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泌乳功能对哺乳动物的生存繁衍至关重要。乳汁不仅可以保证哺乳动物的新生儿存活,同时也为人类生长发育提供了营养物质。动物哺乳期间,多种疾病和亚健康状态均会影响乳腺健康。氧化应激是损害乳腺健康的常见因素,通常会抑制乳腺功能,造成泌乳量和乳品质下降。自然界中的天然活性物质具有抗氧化、抗炎等特性,得到了广泛关注。Nrf2-ARE是目前已知最重要的抗氧化相关信号通路之一,生物活性物质是否可通过Nrf2-ARE途径缓解乳腺氧化应激,值得深入研究。因此,本研究利用Nrf2敲除小鼠,解析了Nrf2-ARE途径在乳腺氧化应激中的作用机制,随后以乳腺上皮细胞为模型探究可通过Nrf2-ARE通路抵御氧化应激的生物活性物质,并阐明其作用机制。本研究旨在为Nrf2-ARE信号通路抵御乳腺氧化应激的分子机制提供理论依据,为定向调控和防治乳腺氧化应激的饲料添加剂开发奠定科学基础。1 Nrf2基因敲除对小鼠生长繁殖和乳腺健康的影响本研究首先对小鼠进行基因型鉴定,确定Nrf2基因型不影响母鼠生长繁殖性能和10-12周龄母鼠哺乳期6-11天平均泌乳量,明确Nrf2基因敲除小鼠可用于乳腺健康研究。继而选用10-12周龄泌乳早期（第3天）WT、Nrf2（+/-）和Nrf2（-/-）小鼠各6只,每只小鼠第四对乳腺的一侧注射50μL LPS（0.2 mg/ml）作为处理组,另一侧乳腺注射50μL PBS作为对照组,注射后24 h采集第四对乳腺组织。另取10-12周龄泌乳中期（第12天）WT、Nrf2（+/-）和Nrf2（-/-）小鼠各5只,分别注射LPS和PBS后3 h取乳样。分析乳腺组织外观、乳中蛋白含量、乳腺炎性因子和氧化还原平衡相关基因表达,综合判断乳腺健康情况。结果表明,应激条件下Nrf2（-/-）小鼠的乳腺组织中β酪蛋白基因表达显著升高,κ酪蛋白基因表达显著降低,而WT小鼠乳蛋白基因无明显变化。转录组学结果显示,LPS处理后,Nrf2（-/-）小鼠乳腺血红素加氧酶1（HO-1）、谷氨酸/胱氨酸反向转运体轻链（x CT）和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基（GCLM）的m RNA水平显著低于WT小鼠,同时总抗氧化能力明显降低。应激条件下Nrf2（-/-）小鼠乳腺出现更多炎性因子表达上调。以上结果提示,相比WT小鼠,Nrf2（-/-）小鼠乳腺的氧化还原平衡被打乱,乳腺健康更易受到外界刺激的不利影响。2 Nrf2-ARE信号通路抵御小鼠乳腺氧化损伤的作用机制本试验使用上述泌乳早期（第3天）小鼠注射LPS 24 h后采集得到的第四对乳腺组织样本,检测乳腺抗氧化酶类表达、谷胱甘肽（GSH）含量、GSH与还原性谷胱甘肽（GSSG）比例、GSH合成与代谢相关基因表达、细胞凋亡与内质网应激情况。结果表明,LPS刺激不改变WT小鼠的过氧化氢酶和过氧化物还原酶1表达,但在Nrf2（-/-）小鼠乳腺降低了以上抗氧化酶表达。LPS刺激上调了WT小鼠乳腺Nrf2和HO-1的基因表达,但Nrf2（-/-）小鼠中未见明显上调。此外,两种Nrf2敲除小鼠未能如WT小鼠一样,受到LPS诱导后显著上调GSH含量和GSH/GSSG比例。Nrf2（-/-）小鼠中谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、GCLM和x CT的m RNA表达丰度在LPS应激条件下也低于WT小鼠。另外,LPS处理增加了Nrf2（-/-）小鼠中促凋亡因子（BAX）的表达、BAX/Bcl-xl比例和内质网应激标记物（GPR78）表达,而WT鼠未见明显差异。以上结果提示,Nrf2-ARE信号通路同时调节酶类和非酶类抗氧化防御系统,可通过Nrf2/GCL/GSH/GPx1途径准确调控GSH的合成与消耗,并且对细胞凋亡和内质网应激也具有影响作用。3 Nrf2-ARE通路介导槲皮素抵御乳腺上皮细胞氧化损伤的作用机制3.1槲皮素抵御乳腺上皮细胞氧化损伤的作用效果本试验旨在探究可缓解乳腺氧化应激的生物活性物质。首先采用不同浓度H2O2（50,100,250,500,750,1000μΜ）刺激乳腺上皮（HC11）细胞24 h建立氧化损伤模型。使用不同浓度槲皮素（0、5、10、15、20、25μΜ）刺激HC11细胞24 h,确定HC11细胞耐受浓度,检测槲皮素预处理2 h对H2O2引起的HC11细胞增殖受阻和乳酸脱氢酶（LDH）释放的改善效果。随后,将HC11细胞分为四组处理,槲皮素和槲皮素预处理组使用20μΜ槲皮素培养细胞;2小时后,H2O2和槲皮素预处理组加入100μΜH2O2培养细胞24小时,对照组使用无血清培养基培养。对四组细胞提取蛋白,检测CAT与SOD活性、抗氧化蛋白（x CT,GCLM,TXNRD1）表达和细胞凋亡相关蛋白（BAX,BCL-2）表达。结果发现100μΜH2O2可降低HC11细胞活力至对照组60%以下,LDH释放达到24%以上,适合作为应激研究模型。20μΜ槲皮素对HC11细胞的保护效果最好,可显著恢复H2O2造成的T-AOC降低,且槲皮素预处理显著改善了细胞的抗氧化酶活性和抗氧化蛋白表达,但对细胞凋亡未见明显影响。以上结果提示槲皮素具有改善HC11细胞增殖受阻、细胞毒性和氧化损伤的重要作用。3.2 Nrf2-ARE通路介导槲皮素抵御乳腺上皮细胞氧化损伤的分子机制本试验旨在阐明Nrf2-ARE信号通路介导槲皮素改善HC11细胞氧化损伤的分子机制。首先将HC11细胞分为四组处理,处理方式如上文所述,探究槲皮素对应激状态下Nrf2-ARE和MAPKs信号通路激活情况的影响。随后,使用信号通路抑制剂,探究Nrf2-ARE信号通路对MAPKs通路调控槲皮素作用的调控机制,研究两者在槲皮素抵御氧化应激中的关系。最后,将细胞分为7组,其中对照组、H2O2组和槲皮素预处理组处理方法如上文所述。抑制剂组分别使用Nrf2抑制剂ML385（5μM）、p38 MAPK抑制剂SB203580（25μM）、ERK抑制剂PD98059（100μM）和JNK抑制剂SP600125（10μM）预处理HC11细胞1小时,之后添加槲皮素处理2小时,最后使用H2O2刺激细胞24小时,检测细胞增殖、细胞毒性、抗氧化防御系统的变化,以阐明抗氧化相关信号通路在槲皮素抵御氧化应激中的重要作用。结果表明,H2O2造成HC11细胞Nrf2-ARE信号通路被激活,MAPKs信号通路也被激活。槲皮素预处理显著改善了Nrf2-ARE和MAPKs信号通路激活情况。ERK抑制剂显著提高p-NRF2/NRF2比例,p38 MAPK抑制剂显著降低p-NRF2的蛋白表达,提示p38 MAPK和ERK信号通路可能通过调节Nrf2-ARE信号途径的激活状态,从而影响槲皮素的抗氧化能力。四种抑制剂均显著降低了槲皮素对细胞增殖的改善作用,不影响槲皮素的抗细胞毒性。对抗氧化防御系统来说,槲皮素对T-AOC的改善作用主要依赖于Nrf2-ARE、p38 MAPK和ERK通路,x CT表达主要依赖于Nrf2-ARE信号途径,槲皮素对CAT酶活和GCLM表达的恢复作用同时受到Nrf2-ARE和MAPKs信号通路的调节。综上所述,Nrf2-ARE信号通路调节下游抗氧化酶表达,介导Nrf2/GCL/GSH/GPx1途径调控GSH的合成与消耗,对细胞凋亡和内质网应激具有调节作用,以此维持乳腺氧化还原平衡。Nrf2-ARE信号通路介导槲皮素改善HC11细胞增殖和抗氧化防御能力,恢复氧化还原平衡。此外,MAPKs信号通路也参与调节槲皮素的细胞保护功能。