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大薯(Dioscorea alata乙.)是继马铃薯、木薯和甘薯之后最重要的薯类作物,是一种药食兼用的特色传统蔬菜。但大薯是深根类作物,它会在地下生长往往长达一米,采挖十分困难。如何获得块茎粗短的高产新品种,是大薯育种中的一项非常具有挑战性的工作。研究大薯块茎膨大的机制,筛选调控结薯过程中的关键转录因子,可为今后大薯分子育种的研究提供科学支撑和依据。本课题基于公布的大薯转录组数据库和拼接基因组序列,系统分析大薯ERF家族的序列及表达特征,并从中挖掘出与块茎发育相关的ERF基因:DaERF24。同时,通过RT-qPCR分析DaERF24在大薯不同组织的表达特征。此外,成功在大薯中构建原生质体高效提取和转化体系,利用该体系成功对DaERF24进行了亚细胞定位研究。并在构建大薯通用CRISPR/Cas9表达载体的基础上,又进一步构建DaERF24-CRISPR/Cas9基因敲除载体。主要研究结果如下:1.基于公布的大薯转录谱序列和基因组序列,开展了对大薯ERF家族基因的挖掘与特征分析。共找到41个DaERF基因,其中14个DaERF有一个以上的外显子,其余的均为一个外显子。进一步的blastx分析发现30个DaERF基因具有保守的AP2结构域,依据AP2序列构建系统进化树,将其分成5个亚家族。通过对AP2结构域的两个保守motif位置和结合位点的分析发现相同家族的ERF蛋白具有相似的结构特征。根据大薯转录谱分析DaERF在不同组织中的表达,发现一些DaERF的表达具有组织特异性,并且属于同一亚家族的基因表达具有相似性。我们对在块茎中具有高表达的DaERF24,使用RT-qPCR验证其在不同组织中的表达量,结果与转录谱数据一致。2.采用大薯幼嫩的第2-3片叶作为酶解大薯原生质体的材料,分别探究酶液组合、甘露醇浓度、酶解时间、酶解液PH值对大薯原生质体产量和活力的影响。结果显示:当纤维素酶0.8%、离析酶1%、甘露醇14%、0.2M MES、2M Kcl、0.1%BSA、1M Cacl2、PH5.8时,大薯叶片原生质体的产量达到最高为:3.70x107(g FW),活力也达到最大值95.89%。3.设置PEG4000的浓度梯度和诱导时间梯度,探究大薯原生质体瞬时表达体系转化效率的变化情况。结果显示:当PEG4000的终浓度为20%,诱导时间为20 min时,达到了最大的转化效率66.23%。并将DaERF24和PA7载体连接构建GFP融合表达载体,转入大薯原生质体中,对DaERF24蛋白瞬时表达产物检测表明:PA7-DaERF24在细胞核中具有较强的荧光信号。4.以大薯DNA序列为模板,利用随机引物(RAPD)、巢式PCR、启动子库三种方式相结合,扩增大薯U3启动子,并构建大薯通用CRISPR/Cas9表达载体。其中采用 pmoles 数比为 1:10 进行 pCAMBIA1301-DaU3pro-2NLScas9 和 35T-BcLI的单酶切连接反应,成功构建载体。5.按照大薯转录组数据库中的DaERF24基因序列,筛选出DaERF24基因的靶标序列。以接头的形式和大薯通用CRISPR/Cas9表达载体连接后形成了DaERF24基因的 2 个敲除载体(ERF1-A-2-CRISPR-Cas9 和 ERF1-A-20-CRISPR-Cas9),即DaERF24-CRISPR/Cas9基因敲除载体。之后转化农杆菌EHA105和LBA4404形成表达载体。