出核抑制剂来普霉素B(LMB)诱导急性早幼粒细胞白血病细胞PML核小体形成分子机制研究

来源 :内蒙古医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yanwensen
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目的:(1)探究出核抑制剂来普霉素B(Leptomycin B,LMB)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞内PML核小体形成过程中关键的参与蛋白。(2)进一步探究在APL细胞中该参与蛋白是如何使弥散分布的PML蛋白及PML-RARα融合蛋白重组为PML核小体,从而阐明LMB诱导APL细胞PML核小体形成的分子机制,为临床治疗APL提供新思路及新方法。方法:(1)将急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4细胞)或APL患者原代细胞株常规培养,用三种不同的出核抑制剂(LMB、KPT-185、TBB)处理,利用免疫荧光显微镜观察PML蛋白及PML核小体的分布及形态变化,确认三种出核抑制剂对NB4细胞核内PML核小体形成的影响;(2)在Hela细胞及敲除内源性PML蛋白的Hela(PML-/-Hela)细胞中过表达PML-RARα融合蛋白,利用免疫荧光显微镜观察LMB对PML核小体形态的影响,确认内源性PML蛋白在此过程中的作用;(3)利用同源重组法,构建GFP-PML-I、GFP-PML-II、GFP-PML-III及GFP-PML-VI质粒,进一步对比不同的PML家族蛋白对LMB诱导PML核小体形成过程的影响,例如:在PML-/-Hela细胞中分别将GFP-PML-I~VI与Flag-PML-RARα共同转染,利用免疫荧光显微镜观察LMB对PML核小体形态的影响,确认LMB所影响的PML蛋白亚型;(4)利用同源重组构建缺失突变体GFP-PML-I-△NES质粒,在PML-/-Hela细胞中共转染GFP-PML-I-△NES与PML-RARα质粒,通过免疫荧光显微镜观察PML核小体的形态变化;(5)通过免疫蛋白印迹法(Western-blot法),检测PML-RARα融合蛋白表达水平变化以及细胞核内PML-I蛋白分布水平变化;(6)通过流式细胞术检测细胞分化标记物CD11b的表达;(7)使用Image J软件对免疫荧光和Western-blot试验结果进行统计和定量。结果:(1)三种不同的出核抑制剂(LMB、KPT-185、TBB)对NB4细胞以及APL原代细胞内弥散分布的PML蛋白及PML-RARα融合蛋白,均有显著的诱导其重组为PML核小体的作用,证明LMB在APL细胞中能够重组PML核小体是由于其抑制了相关蛋白的出核转运过程;(2)在缺失内源性PML基因的PML-/-Hela细胞中过表达PML-RARα融合蛋白,LMB无法诱导弥散的PML-RARα融合蛋白形成PML核小体,证明在LMB作用于APL细胞时,内源性PML蛋白在其中起到了至关重要的作用;(3)当使用LMB抑制PML-I蛋白出核时,可诱导弥散分布的PML蛋白及PML-RARα融合蛋白形成PML核小体,且LMB对其他PML蛋白亚型无效;当突变掉PML-I蛋白的核输出序列(Nuclear Export Sequence,NES)使其停留在细胞核内时,即使不使用LMB处理,本应弥散分布的PML蛋白及PML-RARα融合蛋白此时仍聚集为PML核小体,其结果与LMB抑制PML-I出核(即PML-I蛋白停留在核内)的结果一致。以上结果证明,LMB主要通过抑制PML-I蛋白出核转运,使PML-I蛋白停留在细胞核内,从而诱导APL细胞内弥散的PML蛋白及PML-RARα融合蛋白形成PML核小体。另外我们还发现增加细胞核内PML-I蛋白,会使弥散的PML蛋白及PML-RARα融合蛋白重组为PML核小体。结论:出核抑制剂LMB诱导APL细胞中PML核小体重组的分子机制为:LMB通过抑制PML-I蛋白的出核转运,使PML-I蛋白停留在细胞核内,从而增加细胞核内PML-I蛋白的分布量,最终致使被PML-RARα融合蛋白破坏的PML核小体重新聚集。
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