功能性氨基酸不仅是蛋白质合成的底物,而且可以作为生物活性物质参与细胞内信号转导过程。已有研究证明,功能性氨基酸在乳蛋白合成调控过程中起着重要作用。本研究采用体内灌注技术和体外乳腺上皮细胞培养法,通过对机体物质代谢及内分泌的变化、细胞内氨基酸转运载体和调控乳腺细胞内酪蛋白合成重要信号通路的研究,探讨亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg)对奶牛乳蛋白合成的作用机制。试验一、泌乳奶牛颈静脉与乳腺氨基酸供应关系的比较研究本试验选用3头泌乳中期(88±13d)、体重相近(523±27kg)荷斯坦奶牛作为试验动物,分别采用下游稀释法和菲克原理比较研究奶牛颈静脉与乳腺两位点的血浆流量,分析它们之间氨基酸供应的相关性。所有试验牛在试验前一周进行插管手术,在左侧颈动脉安装永久性血插管。试验前一天在颈静脉临时安装留置针以便进行血流量标记物对氨基马尿酸(pAH)的灌注。结果表明:乳腺平均血浆流量呈现出高于颈静脉血浆流量的趋势(P=0.085),苏氨酸(Thr)(r=0.768)、缬氨酸(Val)(r=0.483)、异亮氨酸(Ile)(r=0.573)、亮氨酸(Leu)(r=0.7)、组氨酸(His)(r=0.844)和精氨酸(Arg)(r=0.569)在颈静脉和乳腺之间的供应量均存在较强的相关,而蛋氨酸(Met)(r=0.161)、苯丙氨酸(Phe)(r=0.339)和赖氨酸(Lys)(r=0.383)在两位点的供应量虽然相关性较弱,但由于此三种氨基酸在尾动脉与颈静脉处浓度相近(C/J分别为97.2%、108.1%和116.2%),加之乳腺血浆流量高于颈静脉的,所以有足够Met、Phe和Lys供给到乳腺,因此,本试验研究证明颈静脉灌注方式是研究奶牛乳腺氨基酸营养代谢调控的可行方法。试验二、颈静脉灌注两种模式氨基酸混合物对奶牛乳蛋白合成的影响选择8头泌乳中期(82±11d)荷斯坦奶牛作为试验动物,试验采用随机区组设计,将试验牛随机分为2组,分别由颈静脉灌注按两种不同模式配制的混合氨基酸(160 g):酪蛋白氨基酸模式混合氨基酸(Casein组)和理想模式混合氨基酸(R组),。两个试验组分别以各自灌注前作为空白对照组(C1和C2组),试验预试期14 d,灌注期5 d。试验采用全混合饲粮(TMR),以玉米、豆粕、棉粕、玉米青贮、苜蓿干草和羊草为主要原料参照NRC(2001)奶牛饲养标准配制。结果表明,灌注酪蛋白氨基酸模式混合氨基酸后奶牛乳蛋白产量和乳蛋白率较灌注前呈上升趋势(7.14%,P=0.078;3.27%,P=0.072);并且,奶牛尾动脉血浆中Ile、Leu、Lys和His浓度较灌注前有不同程度的上升(31.5%,P=0.097;65.9%,P=0.041;36.9%,P=0.088;40.1%,P=0.01).01),而 Thr、Val、Met、Phe 和 Arg 的浓度在数值上较灌注前高但无显著差异(P>0.05)。灌注理想模式混合氨基酸后乳蛋白率比灌注前有上升趋势(5.78%,P=0.064),而乳脂产量显著低于灌注前(8.57%,P=0.015);灌注理想模式混合氨基酸后,奶牛尾动脉血浆中Arg浓度有上升趋势(18%,P=0.093),而酪氨酸(Tyr)浓度呈下降趋势(47.8%,P=0.074)。灌注混合氨基酸后,酪蛋白氨基酸模式组乳脂产量增量显著高于理想模式组(P=0.012),且酪蛋白氨基酸模式组的乳产量增量和乳糖产量增量较理想模式组有升高的趋势(P=0.095;P=0.091)。而其他指标增量无明显差异(P>0.05)。在本试验条件下,颈静脉灌注酪蛋白氨基酸模式和理想模式混合氨基酸均可提高泌乳奶牛的乳蛋白率,而灌注酪蛋白氨基酸模式混合氨基酸同时可促进乳蛋白产量的升高,因此,颈静脉灌注酪蛋白氨基酸模式混合氨基酸效果优于灌注理想模式混合氨基酸。试验三、颈静脉灌注酪蛋白氨基酸模式和缺乏亮氨酸或精氨酸的混合氨基酸对泌乳奶牛乳蛋白合成的影响选择8头健康的体重相近(509 ± 56 kg),平均泌乳天数(DIM)为108±11 d的荷斯坦奶牛作为试验动物。试验采用有重复4×4拉丁方设计,试验牛随机分为4组,分别由颈静脉灌注生理盐水(对照组,CTL)、按酪蛋白氨基酸组成配制的160 g混合氨基酸(酪蛋白氨基酸模式灌注组,Casein)、酪蛋白氨基酸模式下去除亮氨酸(亮氨酸缺乏组,-Leu)和酪蛋白氨基酸模式下去除精氨酸(精氨酸缺乏组,-Arg)。每期试验12 d,灌注期5 d,间隔期7 d。试验采用全混合饲粮(TMR),其组成以玉米、豆粕、棉粕、玉米青贮、苜蓿干草和羊草为主要原料参照NRC(2001)奶牛饲养标准配制。结果表明,各组间干物质采食量无显著差异;Casein组乳产量(P<0.001)、乳蛋白产量(P<0.001)和乳蛋白效率(P=0.099)均显著提高;而-Leu组以上指标较Casein组均下降(P<0.06),这与-Leu组中Leu血浆浓度显著降低(48%,P<0.001),Val和Ile浓度显著提高(20%,P=0.008;34%,P=0.006)有关。与Casein组相比,-Arg组中Arg浓度较Gasein组有下降趋势(16%,P=0.073),进而导致-Arg组的乳产量(P=0.073)、乳蛋白产量(P=0.011)和乳蛋白效率(P=0.037)较Casein组低。泌乳奶牛颈静脉灌注混合氨基酸对营养物质表观消化率和血液学指标无影响(P>0.05)。总之,补充平衡模式的氨基酸可以提高乳蛋白效率促进牛乳生产;当Leu供给水平降至8.4%MP,由于血液中低Leu高Val和Ile的供给,使得BCAA的共同限制作用在一定程度上抑制乳蛋白合成;而当Arg供给水平降至4.6%MP,乳蛋白合成产生负效应。在本试验条件下降低Arg(4.6%MP)和Leu(8.4%MP)供给均会抑制乳蛋白的合成,所以,Arg和Leu是乳蛋白合成的重要功能性氨基酸。试验四、奶牛乳腺上皮细胞中亮氨酸通过氨基酸转运载体(LAT1)介导mTOR信号通路的研究通过饥饿时间点筛选试验确定饥饿培养液1培养12 h作为最适饥饿时间点进行后续试验。本研究以BMEC为研究对象,采用随机试验设计将体外培养的乳腺上皮细胞分为不同处理:酪蛋白氨基酸模式组(按酪蛋白氨基酸组成配制的培养基,CTL);Leu缺乏组(酪蛋白氨基酸模式一Leu,-Leu);Gln缺乏组(酪蛋白氨基酸模式-Gln,-Gln);Leu和Gln缺乏组(酪蛋白氨基酸模式一Leu-Gln,-Leu-Gln)。结果显示,当缺乏Leu或Gln,或者同时缺乏Leu和Gln均能抑制亮氨酸转运载体(LAT1)的表达(P<0.05),同时亮氨酰-tRNA合成酶(LARS)的表达量(P<0.05)也显著下降,而-Gln组未达到显著水平。也正如预期,mTOR和磷酸化mTOR蛋白表达均有不同程度的降低,从而使下游信号分子S6K1的磷酸化蛋白(P<0.05)均显著下降,最终导致K-酪蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)。因此,Leu可能是通过氨基酸转运载体LAT1刺激细胞内LARS的活化介导mTOR信号通路,进而促进κ-酪蛋白的合成。总之,采用颈静脉灌注方式研究奶牛乳腺氨基酸营养调控是可行的;供给平衡的氨基酸模式可提高奶牛乳蛋白效率,当Leu和Arg的供给量占代谢蛋白的百分比分别降至8.4%和4.6%时,奶牛乳蛋白合成受到抑制;体外研究证实,Leu可能是通过氨基酸转运载体LAT1和亮氨酰-tRNA合成酶(LARS)介导mTOR信号通路,进而影响K-酪蛋白的合成。