第1章 TrkA基因的克隆、测序及真核表达载体pcDNA3.1(+)/TrlA 的构建。 目的：构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/TrkA，为研究TrkA过度表达与神经干细胞定向分化关系提供基础。 方法：根据TrkA的cDNA(complementary deoxyribonucleic acid)序列设计合成一对引物，上下游引物的5’端分别引入EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点及保护碱基，采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法从大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(PC12 cells)的总RNA(ribose nucleic acid)中扩增出TrkA基因的cDNA片断，行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化PCR产物，并进行序列测定。用EcoR ⅠI和Xh10 Ⅰ双酶切，将目的基因定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中，转化E.coli DH5α感受态细胞，通过限制性内切酶双酶切、PCR(polymerase chain reaction)及核酸序列分析等筛选、鉴定重组质粒。 结果： 1.TrkA基因cDNA的克隆从PC12细胞提取的总RNA符合实验要求，用RT-PCR法体外扩增出TrkA基因cDNA，并经琼脂糖凝胶电泳及测序证实片断正确。 2.真核表达载体pcDNA3.1(+)/TrkA的构建所构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/TrkA经EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切回收片断分别为2.4kb和5.4kb；PCR及测序证实pcDNA3.1(+)/TrkA质粒基因组中包含TrkA基因cDNA。 结论：成功克隆TrkA基因cDNA，构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/TrkA，为进一步研究TrkA基因过度表达与神经干细胞定向分化奠定了基础。 第2章 TrkA基因修饰、诱导C17.2神经干细胞体外分化为胆碱能神经元。 目的：观察外源性TrkA基因在C17.2神经干细胞的表达，并研究TrkA基因过表达对神经干细胞定向分化的影响。 方法：行nestin免疫细胞化学染色，鉴定C17.2神经干细胞；采用脂质体法将携带有TrkA基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/TrrkA转染C17.2神经干细胞，Westeinblot观察转染后基因表达情况；MTT法检测载体转染对神经干细胞活性的影响；将正常生长的C17.2神经干细胞随机分成两组(A组和C组)，将重组质粒转染阳性的C17.2神经干细胞随机分成两组(B组和D组)，并用100ng/ml NGF分别作用于C组及D组，应用间接免疫荧光染色方法，观察各组细胞ChAT的表达；western blot检测各处理组TrkA蛋白表达情况。 结果： 1.神经干细胞培养及鉴定Nestin免疫细胞化学化染色示约95﹪神经干细胞呈Nestin抗原阳性。 2.外源性TrkA基因在C17.2神经干细胞的表达Western blot结果显示转染组TrkA蛋白表达明显高于非转染组及空质粒转染组，说明外源性TrkA基因导入靶细胞，并实现蛋白表达。 3.MTT检测细胞活性MTT法检测结果显示：与对照组比较，真核表达载体pcDNA3.1(+)/TrkA及空质粒pcDNA3.1(+)转染神经干细胞，对细胞活性无明显影响。 4.TrkA基因过表达对C17.2神经干细胞向胆碱能神经元分化的影响间接免疫荧光染色显示，经NGF孵育的转染组细胞(D组)约有26﹪呈ChAT阳性，而非转染组(C组)约为9﹪，未经NGF孵育的A、B组未观察到ChAT阳性细胞；转染组(B、D组)TrkA表达较非转染组(A、C组)增多。 结论：应用脂质体法将真核表达载体pcDNA3.1(+)/TrkA转染C17.2神经干细胞，并实现外源性基因的正常表达；应用外源性TrkA基因修饰神经干细胞，造成TrkA基因过度表达，在NGF作用下，可以诱导更多的神经干细胞向胆碱能神经元分化。 目的 第3章TrkA转基因神经干细胞移植对AD模型鼠的治疗作用观察。TrkA转基因神经干细胞移植至动物基底前脑，对AD模型鼠的治疗作用，包括学习记忆能力、病理改变及脑内乙酰胆碱(acetylcholine Ach)含量，以及神经干细胞在脑内迁移和分化。 方法：采用单侧切断穹窿海马伞(fimbria formcis FF)制作隔.海马胆碱能通路损害的AD模型；将实验动物随机分为空白对照组(A组)、FF损伤组(B组)、神经干细胞治疗组(C组)、转基因神经干细胞治疗组(D组)，分别于术后2w和4w用Morris水迷宫对各组大鼠进行学习记忆能力检测，比较其差异；采用Dil荧光示踪剂标记C17.2神经干细胞，观察移植后神经干细胞在脑组织中的移行，同时结合ChAT免疫荧光技术检测神经干细胞的分化情况；应用免疫组织化学技术检测各组大鼠基底前脑区ChAT阳性细胞；用高效液相色谱法(highperformance liquid chromatogram HPLC)测定各组大鼠海马区Ach含量；HE染色观察移植后脑内有无肿瘤生长。 结果： 1.各组大鼠学习记忆能力的比较： 行为学测试结果显示，FF损伤组大鼠的学习记忆能力明显下降；移植后第二周，神经干细胞移植治疗组和转基因神经干细胞移植治疗组大鼠的行为学测试指标明显优于FF损伤组，并且效果持续至第四周仍较明显；经统计学检验，转基因神经干细胞移植治疗对大鼠学习记忆的改善作用较单纯神经干细胞移植显著，但仍未达到对照组水平。 2.C17.2神经干细胞在AD模型鼠脑内的移行及分化： 荧光显微镜下观察，Dil标记的神经干细胞发出亮红色荧光，移植后2w时神经干细胞主要集中在注射针道附近，4w后神经干细胞已明显移行至远离注射部位，向周围迁移；FITC标记的ChAT免疫阳性神经元呈绿色，经图像拟合，成棕黄色的为Dil-FITC阳性细胞，即由移植入脑内的神经干细胞分化而来ChAT免疫阳性细胞；细胞计数后统计分析，神经干细胞移植组和转基因神经干细胞移植组比较，在第二周和第四周，经TrkA基因修饰的C17.2神经干细胞分别有163﹪和20.1﹪的细胞分化成胆碱能神经元，高于同期的单纯神经干细胞移植组(10.5﹪、14.2﹪)。 3.免疫组化检测各组大鼠基底前脑区ChAT阳性细胞； 结果显示，在内侧隔核(MS)和斜角带垂直臂核(VDB)区域，FF组的ChAT阳性细胞大量减少；单纯神经干细胞移植治疗后ChAT阳性细胞增加(P<0.01)：转基因神经干细胞移植治疗使ChAT阳性细胞增加更多，二者相比有统计学差异(P<0.01)。 4.各组大鼠海马Ach含量； 测定结果显示：空白对照组大鼠海马Ach含量最高(599.4 pmol/mg)；较FF损伤组，神经干细胞移植治疗组和转基因神经干细胞移植治疗组大鼠海马中的Ach含量均有增加(P<0.05)，且后二者比较，转基因神经干细胞移植治疗组Ach含量增加更为显著(P<0.05)。 5.HE染色情况： HE染色观察，未发现移植后脑内有肿瘤等形态学方面的改变。 结论：TrkA转基因神经干细胞移植至AD模型鼠脑内，在移植区环境的作用下，能够较多的(较单纯神经干细胞移植)向胆碱能神经元分化，从而增加Ach合成，提高基底前脑胆碱能系统功能，进而有效改善AD模型的学习记忆能力。