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目的:1.观察Smac类似物LCL161对结肠癌细胞株增殖的影响。2.研究LCL161是否通过诱导结肠癌细胞凋亡发挥对其增殖的影响。3.探讨LCL161诱导凋亡的可能机制。方法:1.MTT法检测LCL161对结肠癌细胞SW480及HT-29存活率的影响。2.克隆形成实验检测LCL161对结肠癌细胞克隆形成的影响。3.JC-1染色法检测LCL161对结肠癌SW480及HT-29细胞内ATP水平的影响。4.DAPI染色法检测LCL161对人结肠癌SW480及HT-29细胞株细胞核的影响。5.溴化丙啶(propidium iodide,PI)单染法检测LCL161对结肠SW480及HT-29细胞株凋亡的影响。6.电镜观察LCL161处理结肠癌细胞后细胞亚显微结构的变化。7.Western blot法检测LCL161处理人结肠癌SW480及HT-29细胞株对IAPs(XIAP,c IAP1/2)及TNF-α表达的影响。结果:1 LCL161抑制人结肠癌SW480和HT-29细胞株的增殖1.1 MTT实验结果显示不同浓度LCL161(0,0.2,1,5,10mmol/L)对人结肠癌SW480及HT-29细胞株均抑制细胞存活率的作用,且随着LCL161浓度的增加和作用时间的延长,对细胞存活率的抑制逐渐增强,高浓度LCL161抑制作用较明显。在浓度为10μmol/L时,观察LCL161作用24 h时细胞存活率分别为44.6%,78.6%。1.2克隆形成实验显示LCL161可以抑制人结肠癌SW480及HT-29细胞株的克隆增殖,且随着LCL161浓度的增加,对克隆的抑制逐渐增强。2 LCL161诱导人结肠癌SW480和HT-29细胞株的细胞凋亡2.1 LCL161可以降低JC-1在线粒体膜上的红色荧光强度,提高其绿色荧光强度,说明LCL161可以降低两株细胞的线粒体膜电位。2.2 DAPI染色实验结果显示,LCL161可导致两株乳腺癌细胞内的细胞核浓染,核分裂增多,并和LCL161浓度相关,表明LCL161可引起结肠癌细胞核固缩,分裂。2.3不同浓度的LCL161(0mmol/L,5mmol/L,10mmol/L)处理人结肠癌细胞SW480和HT-29 24 h后,PI单染法检测结果显示:随着LCL161浓度的增加,SW480和HT-29细胞的死亡率逐渐增多,凋亡细胞比例分别为1.6%、30.1%、49.1%和5.8%、14.7%、26.1%。说明LCL161可以诱导结肠癌细胞凋亡。2.4透射电镜(TEM)观察结肠癌细胞受LCL161刺激后的亚细胞显微结构的改变。结果示:相比较空白对照组,实验组(10mmol/L)的较多结肠癌细胞均出现细胞膜皱缩,染色质边集,细胞核固缩及凋亡小体形成等典型凋亡形态学特征。3 LCL161诱导c IAP1降解,促进TNF-α合成,介导结肠癌细胞的凋亡3.1 Western-blot法分别检测LCL161处理后各组结肠癌SW480和HT-29两种细胞株细胞凋亡抑制蛋白(c IAP1、c IAP2、XIAP)的表达水平。从实验的结果可以观察出:1.随着药物浓度的增加,c IAP1的蛋白的表达在两个细胞株中都存在逐渐减少的趋势。2.同样的方法和时间点,但是观察到c IAP2、XIAP的蛋白的表达变化不明显。3.2随着LCL161浓度增高,两株细胞内的TNF-α在PVDF膜上显示出条带逐渐浓深。说明LCL161可以促进外源性细胞凋亡通路配体TNF-α的表达。结论:1 Smac类似物LCL161能够显著地抑制人结肠癌SW480和HT-29细胞株的增殖能力,作为临床治疗结肠癌的新药物具有一定的潜在研究价值。2 Smac类似物LCL161引起的人结肠癌细胞的增殖抑制的可能机制是通过诱导结肠癌细胞发生细胞凋亡实现的。3 Smac类似物LCL161可能通过结合并降解c IAP1以及刺激细胞TNF-α的合成和分泌,进而调控结肠癌细胞凋亡。