【摘 要】
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研究背景非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）发病率逐年增加,严重影响人类生命健康,至今仍缺乏有效的手段。NAFLD的疾病特点是早期大量甘油三酯（triglyceride,TG）在肝细胞内沉积引起肝细胞脂肪变性,进而引发非酒精性脂肪性肝炎及肝纤维化,最终可能导致肝硬化和肝癌的发生,疾病早期加强肝脏对TG的降解能力对治疗NAFLD具有指导意义
【基金项目】
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国家自然科学基金（81270908）； 上海交通大学医学院博士创新基金（BXJ201440）；
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研究背景非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）发病率逐年增加,严重影响人类生命健康,至今仍缺乏有效的手段。NAFLD的疾病特点是早期大量甘油三酯（triglyceride,TG）在肝细胞内沉积引起肝细胞脂肪变性,进而引发非酒精性脂肪性肝炎及肝纤维化,最终可能导致肝硬化和肝癌的发生,疾病早期加强肝脏对TG的降解能力对治疗NAFLD具有指导意义。最新研究表明自噬可参与TG的降解,TG经自噬体包裹,输送至溶酶体,被降解成脂肪酸。自噬的增加能同时促进脂肪酸的β氧化,进而减少肝脏脂质的积累。转录因子E3（transcription factor E3,TFE3）被报道作为调控溶酶体生成与自噬发生的重要基因,然而TFE3能否通过调控自噬的发生影响NAFLD目前尚无报道。目的本研究通过观察TFE3对肝细胞脂肪变性时溶酶体生成、自噬发生以及β-氧化功能的影响,深入探讨TFE3对肝细胞脂肪变性的作用及机制,为NAFLD的防治提供新的思路。研究方法1.高脂饮食喂养16周,建立小鼠NAFLD模型;1 mM FFA（油酸:棕榈酸=2:1）刺激肝L02细胞24 h,建立肝细胞脂肪变性模型;Western Blot分别检测两种模型中自噬相关基因的表达情况。2.运用慢病毒介导的基因调控技术,分别构建TFE3过表达与沉默的稳转细胞系;在肝细胞脂肪变性模型中,运用Real-time PCR及Western Blot分别检测过两种稳转细胞系中溶酶体生成与自噬发生相关基因的表达;转染pEGFP-LC3质粒及溶酶体Lyso-Tracker Red染色,观察溶酶体生成与自噬发生。3.油红O染色观察TFE3对细胞脂质沉积影响,并测量细胞内TG含量差异。运用Atg5 siRNA干扰自噬的发生,研究自噬作用在TFE3调节肝细胞脂肪变性中的作用。4.Real-time PCR及Western Blot分别检测脂肪酸β-氧化相关基因的表达。用PGC1αsiRNA沉默PGC1α表达,研究PGC1α在TFE3对脂肪酸β-氧化功能调节过程中的作用。5.运用染色质免疫共沉淀及双荧光素酶报告基因技术验证TFE3对PGC1α的转录调控作用。研究结果1.小鼠NAFLD模型与肝L02细胞脂肪变性模型中,自噬标志物LC3-II与Atg5表达降低,同时代表溶酶体功能的CTSL与VPS11表达也降低;2.过表达TFE3（LV-TFE3）可明显增加溶酶体生成与自噬发生相关基因的表达;相反,沉默TFE3（LV-shTFE3）溶酶体生成与自噬相关基因表达下降。3.LV-TFE3明显缓解肝细胞脂肪变性,而LV-shTFE3加重肝细胞脂肪变性。在自噬作用阻断后,LV-TFE3缓解肝细胞脂肪变性效果几乎消失。4.LV-TFE3明显促进脂肪酸β-氧化作用,改善线粒体呼吸功能。而干扰PGC1α表达后,LV-TFE3促进脂肪酸β-氧化的作用明显下降,肝细胞脂肪变性也加重。5.TFE3可与PGC1α启动子区域2个E-box序列结合,直接转录调控PGC1α的表达。研究结论1.肝细胞脂肪变性时,细胞溶酶体功能下降,同时自噬水平明显不足;2.肝细胞脂肪变性时,TFE3表达下降,过表达TFE3可增加溶酶体的生成及自噬的发生;3.过表达TFE3时,增加的自噬作用促进TG的分解,同时经PGC1α调控的脂肪酸β-氧化作用增强,以降解TG分解产生的脂肪酸,明显缓解肝细胞脂肪变性;4.TFE3转录水平直接调控PGC1α的表达,进而参与对肝细胞脂肪变性的调节。
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