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近年来，应用减毒胞内菌作为DNA疫苗的运送载体受到广泛关注，由于该途径可以通过减毒胞内菌将DNA疫苗定向运送至抗原提呈细胞（APCs）内，因而大大提高了DNA疫苗的摄入效率。该途径在小鼠和鱼类模型中已经进行了大量的研究，不仅能够刺激机体产生针对细菌载体的免疫应答，还能同时激发产生针对所携带DNA疫苗编码的外源抗原的体液免疫、细胞免疫和／或局部粘膜免疫应答，但是在禽类DNA疫苗研究领域，尚未进行过类似的研究。本试验中我们构建了以减毒鼠伤寒沙门氏菌和减毒鸡伤寒沙门氏菌运送的H5亚型高致病性禽流感（HPAI）DNA疫苗，以小鼠和鸡为实验动物对其相关免疫生物学特性进行了研究。 首先根据Genebank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列设计并合成一对PCR引物，通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增鹅源H5亚型AIV毒株A／Goose／Jiangsu／1／2000（H5N1）的HA基因。凝胶电泳结果显示，扩增产物为1.7kb的单一条带，与预期结果相符。将PCR产物克隆入pGEM? T easy Vector并进行测序，结果显示，所获序列与北美群系代表株A／Chicken／Pennsylvinia／1／83（H5N2）的HA基因核苷酸序列的同源性为79.8％，与欧亚群系代表株A／Duck／Ireland／113／83（H5N8）的同源性为88.3％，表明该毒株可能起源于欧亚群系。另外该毒株分别与A／Goose／Guangdong／1／1996（H5N1）和A／HongKong／156／97（H5N1）毒株具有非常高的同源性，说明三者之间的亲源关系比较密切。用Hind-Ⅲ和BamH Ⅰ将HA基因从克隆载体切出，分别插入真核表达载体p VAX1和asd-p VAX1的相应位点构建成重组表达载体p VAX1-HA和asd-p VAX1-HA，转染P815细胞后通过间接免疫荧光试验证明HA基因在该细胞中得到了瞬时表达，说明构建的两种质粒可以用于DNA疫苗试验。最后又将两种真核表达质粒导入减毒鸡伤寒沙门氏菌97A和减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550，构建了3种以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗形式，分别命名为97A（pVAX1-HA）、X4550（pVAX1-HA）和X4550（asd-pVAX1-HA），为进一步通过体内试验研究其免疫生物学特性奠定了基础，3种细菌均对1日龄SPF鸡显示出很好的安全性。同时还将HA基因插入pcDNA3.1（-）载体的Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间构建成重组真核表达载体p cDNA3.1（-）-HA，转染P815细胞后通过G418扬州大学硕士学位论文筛选和间接免疫荧光试验验证，获得了稳定表达HA基因的细胞系PS 15HA，可以用于研究HA蛋白表位特异的细胞免疫应答。 用构建的X4550（pVAXIHA）和X4550（asd一pVAXI.HA）以4周的间隔两次免疫BALB/c小鼠，部分免疫小鼠可以检测到EUSA抗体效价，二免后4周用PS 15一HA细胞腹部皮下接种试验小鼠进行肿瘤细胞攻击，结果免疫组小鼠均未形成肿瘤，而阴性对照和空白对照组小鼠均在接种部位形成实体瘤，说明免疫小鼠可能产生了HA蛋白表位特异性C几效应细胞。结果表明这两种重组细菌对小鼠有很好的免疫原性，能够同时激发细胞和体液免疫应答。 为了确定运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌在体内的动力学分布，将3种重组细菌对两周龄商品代伊莎褐蛋鸡以两周的间隔进行两次口服接种，从第一次接种开始，分别于不同的时间点对各组鸡进行扑杀，无菌采集外周血、肝脏、脾脏、小肠和盲肠样品，用相应的含抗生素的选择性LB平板进行细菌分离计数。结果表明细菌主要定居于盲肠内，至少可以存活一个月以上。携带DNA疫苗后细菌对内脏器官的侵袭力大大降低，X4550（pVAXIHA）和X4550（asd一pVAXI一HA）仅在二免后少数时间点可以在肝脏和脾脏分离到，97A（pvAXI.HA）始终未能在肝脏和脾脏分离到。3种细菌在外周血中均未出现过。结果表明，携带DNA疫苗对宿主菌是一个较重的负担，但是由于能够在盲肠内存活相当长的时间，依然有可能激发产生较强的免疫应答，尤其是粘膜免疫应答。 3种细菌以20天的间隔两次免疫SPF鸡后，通过HI试验可在肠道检测出相当高的粘膜抗体水平，而血清中抗体水平则较低，与此相反，油苗免疫后可检测到较高的血清抗体水平，但是粘膜抗体水平较低。说明肌肉注射月V灭活疫苗以激发全身免疫应答为主，而本试验中所构建的3种以减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗通过口服途径免疫则以激发粘膜免疫应答为主。 用3种以减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗对商品代伊莎褐蛋鸡进行的免疫保护效力试验结果表明，X4550（asd一pVAXIHA）免疫鸡能够产生对强毒攻击的部分保护，保护指数为77.8%，油苗免疫保护指数为33.3%，而x4550（pVAXI.HA）和97A（pVAxlHA）不能对免疫鸡提供保护。 综上所述，本试验中所构建的3种以减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗具有足够的安全性和良好的免疫原性，能够同时激发细胞、体液和粘膜免疫应答，有一定的免疫保护作用，其在生产实践中的应用价值有待进一步评价。