研究背景一氧化氮(nitric oxide, NO)是人体内极为重要的信号分子之一,在维持血管内皮功能和心血管内稳态中发挥着关键作用。NO可通过直接舒张血管,或抑制血管平滑肌细胞增殖、血小板聚集和粘附、以及炎症细胞的浸润等多种机制发挥心血管保护作用。人体内的NO由L-精氨酸经一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)催化生成。非对称二甲基精氨酸(Asymmetric Dimethylarginine, ADMA)是一种内源性一氧化氮合酶抑制剂,能竞争性的抑制NOS的活性,减少NO的生成,从而导致血管内皮功能障碍。血浆ADMA水平升高目前被认为是心血管事件发生新的风险因子和心血管疾病预后的独立预测因子。人体内生成的ADMA主要由二甲基精氨酸水解酶(Dimethylarginine Dimethylaminohydrolase, DDAH)水解。DDAH包括DDAH1和DDAH2两种亚型,DDAH1是代谢血管内皮以及循环血液中ADMA的关键酶,DDAH2则在调节血管内皮依赖性舒张因子(Endothelium Dependent Relaxing Factor, EDRF)诱导的血管舒张中发挥关键作用。通过对核酸序列库进行搜索,发现DDAH1基因存在DDAH1-V1和DDAH1-V2两种转录本。我们推测DDAH1基因两种不同的转录本的表达水平以及编码的DDAH1蛋白在ADMA的代谢中的作用及相互关系可能是心血管疾病的分子机制之一。本研究通过研究原代人脐静脉内皮细胞DDAH1基因不同转录本表达水平与ADMA代谢活性的关系,以探讨DDAH1不同转录本在体内ADMA代谢中的作用以及其可能分子机制。方法1.DDAH1基因不同转录本在不同细胞系中的表达变化使用特异性DDAH1转录本引物RT-PCR扩增原代人脐静脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞株、肝癌细胞株、外周单个核细胞中LDDAH1基因不同转录本并比较其表达。2. DDAH转录本cDNA扩增及测序验证使用DDAH1-V2转录本特异性引物PCR扩增其CDS区和5’-UTR,凝胶电泳进行PCR产物分析。切胶纯化PCR产物并进行Sanger测序,Blast软件对测序后的序列进行分析和比对。3.培养原代人脐静脉内皮细胞检测DDAHl不同转录本表达相关性以及与ADMA代谢活性的关系分离和培养原代人脐静脉内皮细胞HUVECs,荧光实时定量PCR(real-time PCR)法测定细胞内DDAHl不同转录本mRNA表达,第4代细胞用细胞裂解液裂解,用ELISA测定细胞裂解液中ADMA的代谢活性。结果1.DDAHl-V2转录本逆转录PCR产物凝胶电泳出现稍短的电泳条带,经测序验证为新的DDAHl基因转录本(DDAH1-V3),其序列为DDAH1-V2转录本除外显子’2(E’2)以外的所有其他6个外显子。2.在原代培养的人脐静脉内皮细胞中,DDAH1-V3mRNA表达与DDAHl-V2mRNA表达(R=0.811,P=0.000008,n=21)和DDAH1-V1mRNA表达(R=0.454,P=0.039,n=21)均呈显著相关,但DDAH1-V1与DDAH1-V2mRNA表达间无显著的相关性。3.在原代培养的人脐静脉内皮细胞中,DDAHl-V1转录本mRNA表达与细胞裂解液的ADMA代谢活性呈显著相关(R=0.805,P=0.002),但DDAH1-V2和DDAH1-V3转录本的mRNA与细胞裂解液的ADMA代谢活性不相关。结论1.DDAHl-V3是DDAH1基因新的转录本；2.原代人脐静脉内皮细胞中DDAH1-V2与DDAH-V3转录本的表达水平呈正相关；3.DDAH1-V1转录本介导人脐静脉内皮细胞ADMA的代谢,DDAH1-V2和DDAH-V3表达水平与ADMA代谢无关。研究背景非对称二甲基精氨酸ADMA是一种内源性一氧化氮合酶抑制剂,能竞争性的抑制NOS的活性,减少NO的生成,从而导致血管内皮功能障碍。目前研究认为血管内皮功能障碍是心血管疾病发生的病理生理学基础和始动因素。血浆ADMA水平升高是新的心血管事件发生独立风险因子,尤其与血栓性疾病如急性冠脉综合症(acute coronary syndrome, AC S)和中风发生密切相关。人体内的ADMA主要由二甲基精氨酸水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase, DDAH)代谢生成瓜氨酸和二甲胺,近年来的研究证实DDAH1是代谢灭活血管内皮和循环中ADMA的关键酶。通过对NCBI数据库的检索以及本学位论文第一章的研究发现,人类DDAH1基因存在DDAH1-V1、DDAH1-V2和DDAH1-V3三种转录本,在原代培养的健康新生儿来源的人脐静脉内皮细胞中DDAH1-V2转录本与DDAH-V3转录本表达呈显著相关性；然而仅有DDAH1-V1转录本与原代人脐静脉内皮细胞ADMA代谢活性显著相关。在与ADMA升高有关的疾病中,DDAH1基因三个转录本的表达水平变化情况及其临床意义如何尚不清楚。本研究通过对来源于健康个体、急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)患者和急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke, AIS)患者外周血单个核细胞的DDAH1基因不同转录本表达水平以及相关性进行分析,探讨DDAH1不同转录本在AIS和AMI时表达变化可能的意义。方法1.通过采集健康个体外周血单个核细胞(PBMC),检测DDAH1基因不同转录本mRNA表达水平。空腹抽血并梯度离心法分离36例正常健康志愿者的PBMC,应用DDAH1转录本特异性实时定量PCR引物,通过荧光实时定量PCR(real-time PCR)法测定PBMC中DDAH1不同转录本mRNA表达,通过相关性分析查明转录本表达水平间的相关性。2.通过采集急性缺血性脑卒中AIS患者外周血单个核细胞(PBMC),检测DDAHI基因不同转录本mRNA表达水平。空腹抽血并梯度离心法分离35例AIS患者发病6小时内的外周血单个核细胞,使用转录本特异性引物real-time PCR检测DDAHI不同转录本1nRNA表达,通过相关性分析查明转录本表达水平间的相关性。3.通过采集急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)患者外周血单个核细胞(PBMC),检测DDAH1基因不同转录本mRNA表达水平。空腹抽血并梯度离心法分离30例AMI患者发病6小时内的外周血单个核细胞,使用转录本特异性引物real-time PCR检测DDAHl不同转录本mRNA表达,通过相关性分析查明转录本表达水平间的相关性。4.分析比较健康、AIS.AMI三种状态下外周血单个核细胞(PBMC) DDAHI基因不同转录本mRNA表达水平CT值和ACT值(CTDDAH1transcripts-CTGAPDH)用于分析比较健康、AIS.AMI三种状态下外周血单个核细胞(PBMC)DDAH1基因不同转录本mRNA表达水平。结果1.健康个体PBMC中DDAHI-V2和DDAH1-V3转录本mRNA表达水平间呈显著的正相关(R=0.571,p=0.001,n=36)2.AIS患者PBMC中DDAH1-V1、DDAH1-V2和DDAH1-V3三个转录本表达均呈显著正相关性(V1和V2:R=0.700,p=0.00003；V1和V3:R=0.457,p=0.014；V2和V3:R=0.616,p=0.0005,n=35)。3.AMI患者PBMC中DDAH1-V1.DDAH1-V2和DDAH1-V3三个转录本表达均呈显著正相关性(V1和V2:R=0.651,P=0.001；V1和V3:R=0.493,p=0.014；V2和V3:R=0.544,P=0.006,n=30)4.健康个体PBMC中DDAH1-V1,-V2和-V3mRNA的平均CT值分别为29.6±1.5,32.2±2.0和29.6±1.7；AIS患者PBMC中DDAH1-V1.-V2和-V3mRNA平均CT值均分别为28.7±1.1,32.2±2.3,29.7+1.3,AMI患者PBMC中DDAH1-V1、-V2和-V3的平均CT值分别为28.7±1.5,32.1±2.3,29.3±1.5；AIS患者外周血单个核细胞DDAH1-V2转录本(P<0.05)和DDAH1-V3转录本(P<0.01)ACT值均显著高于健康个体。结论1.AIS和AMI患者PBMC中DDAH1不同转录本mRNA表达间的相关性发生改变,V3与V1的相关性增加,而与V2的相关性减弱；2.AIS患者PMBC中DDAH1-V2和DDAH1-V3转录本表达丰度下降,DDAH1-V1转录本表达丰度相对稳定。研究背景心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是一大类严重危害人类健康的疾病,是现如今导致人类死亡的主要原因。心血管疾病包括高血压、动脉粥样硬化、冠心病、心衰和脑卒中。尽管心血管疾病有着不同的表现形式,但是它们的发病过程还是具有不少相似之处。各种炎症因子及其所带来的生理病理学变化在这些疾病的发生发展中起非常重要的作用,且在心脑血管的基础性疾病高血压和动脉粥样硬化互为风险因素中氧化应激及炎症反应可能起桥梁和中介作用。内环境的改变以及不同细胞产生的许多炎症因子,比如干扰素Y(interferon γ, IFNγ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactor a, TNF-α)、白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)都会对内皮细胞的形态和功能造成损伤,破坏血管舒张和血管收缩因素之间的平衡是血管内皮功能障碍的初始原因。非对称二甲基精氨酸(ADMA)是内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制剂,能够抑制eNOS的活性和NO生成。DDAH1在清除血管内皮细胞内和循环血液中ADMA方面发挥主要作用。各种炎症因子及其所带来的生理病理学变化可能通过调控DDAH1三个转录本的表达而引起体内ADMA水平的改变,从而对心血管系统的功能造成一定的影响。本研究通过研究各种炎症因子及其所带来的生理病理学变化对DDAH1三个转录本的表达产生的影响,用以探讨不同内环境的改变对DDAH1三个转录本表达调控的作用以及其可能分子机制。方法1.DDAH1rs233113多态性对健康志愿者PBMC中DDAH1转录本表达的影响签署知情同意书后,空腹抽取36例正常健康志愿者静脉血,梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),志愿者登记表登记受试对象的吸烟、饮酒、性别、年龄及疾病史等信息,并对所有样本DDAH1rs233113A/T位点进行基因分型,real-time PCR检测DDAH1不同转录本mRNA表达,分层分析吸烟与饮酒对各DDAH1三个转录本表达的影响。2.使用DDAH1-siRNA转染人脐静脉内皮细胞株,检测DDAH1不同转录本表达的变化使用不同浓度三种DDAH1-siRNA应用lipofectin瞬时转染试剂转染人脐静脉内皮细胞株24小时,real-time PCR检测DDAHl不同转录本表达,分析siRNA对其表达影响。3.培养人脐静脉内皮细胞株,使用不同药物处理检测其对DDAH1不同转录本表达的影响培养人脐静脉内皮细胞株,分别使用不同浓度血管紧张素Ⅱ、肿瘤坏死因子α、高浓度葡萄糖、辛伐他汀处理24h,real-time PCR检测DDAHl不同转录本表达,分析病理生理因素或药物对DDAHl不同转录本mRNA表达的影响。结果1.在健康人群中,吸烟和饮酒均不影响PBMC中DDAHl各转录本的mRNA表达。在吸烟人群中rs233113AT型个体(n=4)DDAH2-V3表达显著性降低,其他各转录本的表达无显著性变化.。2.DDAH1-siRNA在5nM、10nM、20nM、50nM的浓度情况下均可显著性下调培养的内皮细胞株HUVEC-C中DDAH1-V1、 DDAH1-V2和DDAH1-V3三个转录本mRNA的表达(p<0.01),在作用最大的浓度20nM siRNA作用下,三种siRNA下调DDAH1-V1和DDAH1-V3mRNA表达的作用均达75%以上,但对DDAH1-V2mRNA表达的下调作用不及50%。3.10-6mol/L和10-5mol/L Ang Ⅱ处理HUVEC均可显著降低细胞内DDAH1-V1mRNA表达(p<0.05,与control组相比较),10-5mol/L Ang Ⅱ处理显著下调DDAH1-V2和DDAH1-V3的mRNA表达(p<0.05,与control组相比较)。低浓度的Ang Ⅱ(10-6mol/L)对DDAH1三个转录本mRNA表达均无显著影响.4.不同浓度TNF-α处理均可显著下调DDAH1-V1的mRNA表达,且呈剂量依赖性p<0.05,25ng/ml组和50ng/ml组与control组相比较；p<0.01,100ng/ml组与control组相比较)。中浓度(50ng/ml)和高浓度(100ng/ml)TNF-α均可显著下调DDAH1-V2和DDAH1-V3mRNA的表达(p<0.05,与control组相比较),但低浓度TNF-α(25ng/ml)不影响DDAH1-V2和DDAH1-V3mRNA的表达。5.高浓度D-葡萄糖(50mmol/L)处理HUVEC-C可显著下调细胞内DDAH1-V2mRNA的表达(p<0.05,与甘露醇对照组相比较)高浓度D-葡萄糖(40mmol/L和50mmol/L)也可显著下调HUVEC-C内DDAH1-V3mRNA表达(p<0.05,与甘露醇对照组相比较),但高糖处理不影响细胞内L)DAH1-V1mRNA表达。6.2μM辛伐他汀孵育HUVEC-C24h后,细胞内DDAH1-V2mRNA的表达显著下降(p<0.05,与溶剂对照DMSO组相比较)。1μM和2μM辛伐他汀处理可显著降低HUVEC-C细胞内L)DAH1-V3mRNA的表达(p<0.05,与溶剂对照DMSO组相比较)。但不同浓度的辛伐他汀均不影响HUVEC细胞内DDAH1-V1mRNA表达。结论1.DDAH1rs233113多态性可降低健康吸烟个体PBMC中DDAH1-V3mRNA表达；2.DDAH1-siRNA可抑制内皮细胞内DDAH1三个转录本mRNA的表达,但干扰DDAH1-V1和DDAH1-V3表达的作用更强；3.Ang Ⅱ对DDAH1转录本表达的影响与其浓度有关,高浓度Ang Ⅱ可下调DDAH1三个转录本的mRNA表达;4.不同浓度的TNF-α均可抑制DDAHl三个转录本的mRNA表达；5.高糖处理可下调内皮细胞中DDAH1-V2和DDAH1-V3转录本mRNA的表达,但不影响DDAH1-V1转录本的mRNA表达；6.辛伐他汀可下调HUVEC内DDAH1-V2和1DDAH1-V3mRNA表达,但不影响DDAH1-V1mRNA表达。