猪圆环病毒病2型（Porcine circovirus virus type 2,PCV2）给世界养猪产业造成巨大的经济损失。利用蛋白组学技术已鉴定出许多与PCV2相互作用的宿主蛋白,这些蛋白主要参与PCV2的入胞、运输以及复制等过程。PCV2的亚临床感染可降低仔猪平均日增重,导致免疫失败或者病程加重发展成PCVAD等,但是其致病机制还不是十分清楚。宿主和病原之间的相互作用以及猪体的免疫应答可能与亚临床感染相关。细胞因子、热休克蛋白和穿膜肽等免疫调节因子能够增强先天性免疫和适应性免疫反应,可作为Cap蛋白亚单位疫苗潜在的分子佐剂。因此,深入了解PCV2与宿主蛋白间的相互作用,揭示PCV2亚临床感染的分子机制,发展新型亚单位疫苗可为PCV2的防控提供重要的理论依据和应用前景。本研究中主要研究内容如下:1.血清淀粉样蛋白P成分在猪圆环病毒2型复制中的作用利用免疫沉淀和质谱分析的方法筛选出与PCV2 Cap蛋白相互作用的宿主蛋白血清淀粉样蛋白P成分（Sap）,且用免疫沉淀方法证明两者相互作用。激光共聚焦试验结果显示,Sap蛋白阻止Cap蛋白进入胞核。质粒过表达和体外添加可溶性Sap蛋白可以明显抑制PCV2复制。利用siRNA干扰Sap基因可反向证明Sap对PCV2具有抑制作用。将Sap不同区域截断表达,发现Sap蛋白抑制PCV2复制的功能区域位于Sap蛋白N端第155-163氨基酸（aa）;通过突变Sap蛋白两个配体结合位点155aa和157aa,发现Sap蛋白突变体不能阻止Cap入核,丧失抑制病毒复制的作用,说明Sap蛋白第155aa和157aa为该蛋白抑制PCV2复制的关键活性位点。2.SOCS3在猪圆环病毒2型亚临床感染中的作用采用商品仔猪进行PCV2人工感染,分别采集呈现断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）和无临床症状（亚临床感染）仔猪的外周血单核细胞（PBMC）,测定细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）、白细胞介素（IL）6和肿瘤坏死因子（TNF）-α,发现亚临床感染组SOCS3水平明显高于PMWS组,而IL-6和TNF-α无明显差异。TNF-α和IL-6刺激PCV2亚临床感染猪分离的PBMC,SOCS3水平显著低于无PCV2感染的健康仔猪对照组,而且,NF-κB抑制因子IκB-α蛋白无明显降解。PK-15细胞感染PCV2后SOCS3表达增加,PK-15细胞过表达SOCS3,IκB-α降解明显受到抑制,证明SOCS3在PBMCs和PK-15细胞中的表达可以抑制由炎性因子诱导的NF-κB信号通路。当沉默SOCS3的RNA后,PCV2引起PK-15细胞中IL-6和TNF-α表达量显著增加。此外,SOCS3与信号转导和转录激活因子3（STAT3）和肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）相互作用。研究表明SOCS3通过抑制免疫细胞的炎性反应在PCV2亚临床感染起着重要作用。3.热休克蛋白96N对猪圆环病毒2型Cap蛋白的免疫增强作用利用重组杆状病毒表达系统表达PCV2 Cap蛋白及猪热休克蛋白Gp96 N-端22-370个氨基酸的（Gp96N）,本研究在鉴定得到4种重组杆状病毒基础上进行小鼠试验,结果表明,rBac-Cap/Gp96N能诱导产生较高水平PCV2中和抗体和细胞免疫应答水平。由此,采用rBac-Cap/Gp96N和rBac-Cap对PCV2、PRRSV阴性商品仔猪进行免疫保护试验,结果表明,rBac-Cap/Gp96N免疫组PCV2抗体水平、外周血单核细胞的增殖反应及IFN-y水平均明显高于rBac-Cap组。免疫后35天采用PCV2强毒攻击,结果显示,rBac-Cap/Gp96N和rBac-Cap免疫组均没有明显临床症状,相对日增重明显高于攻毒对照组（CC）,病理损害程度明显低于攻毒对照组。同时,rBac-Cap/Gp96N免疫组病毒血症和淋巴结病毒载量均显著低于rBac-Cap组。表明猪Gp96N可以有效增加PCV2 Cap的体液和细胞介导的免疫反应应答。Gp96N可以作为PCV2亚单位疫苗分子佐剂提高疫苗对猪的免疫保护效果。4.白介素-21对猪圆环病毒2型Cap蛋白的免疫增强作用采用PCR方法扩增白介素（IL）-21基因,以不同方式克隆至杆状病毒质粒pFast-Bac-Dual,鉴定正确后再将重组质粒转化DH10Bac感受态,经两轮蓝白斑筛选正确转座到Bacmid的克隆;提取基因组并用脂质体将Bacmids转染进Sf9昆虫细胞,待出现细胞病变后收集细胞蛋白进行Western blot和免疫荧光鉴定,确定获得重组杆状病毒 rBac-IL-21（表达 IL-21 基因）、rBac-Cap-IL-21（融合表达 Cap 和 IL-21 基因）、rBac-Cap/IL-2l（单独表达 Cap 和 IL-21 基因）。采用 rBac-IL-21、rBac-Cap-IL-21、rBac-Cap/IL-21和rBac-Cap免疫小鼠两次,间隔3周,免疫后35天采血或取出脾脏,分别检测PCV2抗体、淋巴细胞增殖、细胞因子IL-4和IFN-γ。结果表明:rBac-Cap-IL-21、rBac-Cap/IL-2l 和 rBac-Cap 免疫组均能产生较高的 PCV2 ELISA 抗体和中和抗体水平,其中rBac-Cap-IL-21免疫组抗体水平最高。IL-21可以提高Cap蛋白引起的特异性淋巴细胞增殖,rBac-Cap-IL-21组刺激淋巴细胞产生的IFN-y水平明显高于rBac-Cap组和对照组。首次免疫后35天,采用PCV2强毒攻击,攻毒后7、14和21天取脾脏,用荧光定量PCR方法检测PCV2载量,结果表明,rBac-Cap-IL-21组病毒载量显著低于攻毒对照组,且低于其他免疫组。这些结果表明,猪IL-21可以有效增加PCV2 Cap的体液免疫和细胞免疫应答。IL-21与Cap基因融合后可以增加Cap亚单位疫苗对小鼠的免疫保护效果,为进一步研究新型的亚单位疫苗奠定了基础。5.穿膜肽和蜜蜂蜂毒分泌信号肽对杆状病毒表达PCV2 Cap蛋白的影响通过PCR方法扩增获得穿膜肽ppTG20、TAT以及蜜蜂蜂毒分泌信号肽（HBM）基因,将穿膜肽以及信号肽HBM基因串联在Cap基因N端,克隆至pFast-Bac-Dual（构建在p10启动子下）表达质粒。重组质粒经酶切和基因测序鉴定正确后,分别转化DH10Bac感受态,经蓝白两轮斑筛选正确转座到Bacmid的克隆;提取基因组并用脂质体将Bacmids转染进Sf9昆虫细胞,待细胞病变出现后收集病毒,获得重组杆状病毒 rBac-ppTG20-Cap、rBac-TAT-Cap 和 rBac-HBM-Cap。采用 Western blot、间接免疫荧光和电镜观察进行鉴定,结果证明,穿膜肽融合Cap基因在杆状病毒表达系统中获得表达良好,穿膜肽不影响Cap蛋白病毒样颗粒的形成,但HBM没有促进Cap蛋白分泌性表达。6.PCV2a和PCV2b鉴别PCR检测方法的建立与应用本研究根据PCV2a和PCV2b基因序列特征,设计PCR引物,成功建立PCV2a和PCV2b鉴别PCR检测方法,其敏感性分别为9.74fg/μL和16.3fg/μL,与PPV、PRV、PRRSV等病毒没有交叉反应性。采用该方法对我国华东地区125份PMWS淋巴组织样品检测,结果显示,单独感染 PCV2a 占 8.0%（10/125）,PCV2b 占 41.6%（52/125）,PCV2a和 PCV2b共感染占50.4%（63/125）。选取PCV2a和PCV2b单独感染的淋巴结组织病料进行病毒分离和全基因序列分析,结果分离获得4株PCV2b和1株PCV2a,与该鉴别PCR检测结果一致,证明本研究建立的PCR方法可以有效鉴别PCV2a和PCV2b,具有较高特异性和敏感性,可用于PMWS临床样品中PCV2快速检测。