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麦草畏（3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸,又名百草敌）属于苯甲酸类激素型选择性除草剂,对一年生和多年生阔叶杂草有很好的防除效果,自1962年问世以来,在世界范围内得到广泛使用。生物技术的兴起带来了一个全新的农田杂草控制时代:以美国生物技术巨头孟山都公司的草甘膦和抗草甘膦转基因作物（转cp4-EPSPS基因）组合为代表,两者配套使用可以在保证农作物安全前提下极有效地控制农田杂草。2013年全球种植了 26.3亿亩转基因作物,具有抗除草剂性状占比超过80%,其中绝大多数是抗草甘膦性状,但长期使用草甘膦带来严重的杂草抗性问题。麦草畏因其具有广谱、高效、低毒和对杂草产生抗性慢等优点成为理想的抗除草剂转基因工程靶标除草剂,它可以弥补草甘磷的不足。目前孟山都利用来自细菌的麦草畏脱甲基酶基因dmo成功构建抗麦草畏的转基因大豆和棉花,已经通过相关机构的安全性评估,于2015年进入商业化推广阶段。因此有必要深入研究环境中麦草畏的迁移、转化和微生物降解机制,为评估麦草畏规模化应用后的环境行为、毒理和生态安全性提供依据。同时我国目前缺乏具有自主知识产权的抗除草剂基因（酶）资源,获得新的具有自主知识产权的麦草畏降解基因在构建抗麦草畏作物中具有很好的应用前景,对推动我国抗除草剂转基因工程技术发展具有重要意义。大量的研究表明微生物代谢是土壤中麦草畏降解的主要因素,目前国外已经分离到多株麦草畏降解菌株,这些菌株降解麦草畏的起始步骤一般是脱甲基形成没有除草活性的DCSA,催化这一反应的脱甲基酶有两类:好氧菌Stenotrophomonas maltophilia DI-6中麦草畏脱甲基酶DMO（dicamba monooxygenase）,一类Rieske非血红素铁氧化酶（Rieske non-heme iron oxygenase,RHO）和厌氧菌 Moorella thermoacetica中四氢叶酸依赖型麦草畏脱甲基酶Mtv。本论文以本实验室分离保存的一株好氧型麦草畏降解菌Sphingomonas sp.Ndbn-20为研究材料,通过基因组信息分析和酶学研究,克隆到两个新的四氢叶酸依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt50和dmt66,研究了这两个酶的异源表达和酶学特性。合作研究单位北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心将脱甲基酶基因dmt50和dmt66导入到拟南芥中,获得了很强的麦草畏抗性,表明四氢叶酸依赖型的脱甲基酶基因在作物抗除草剂转基因工程中有很好应用的前景。此外本研究还首次发现纯化的Mthfr66是一个多功能酶,具有麦草畏脱甲基酶活性和5-methyl-THF氧化还原酶活性。本研究主要研究结果如下:一、四氩叶酸依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt50和dmt66的克隆和功能验证利用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术获得菌株Sphingomonas sp.Ndbn-20的基因组草图,该基因组草图共有127个contigs,大小为5.35 Mb,编码4911个ORF。为克隆麦草畏脱甲基酶基因,利用OMIGA 2.0软件的dot plot功能将菌株Ndbn-20基因组序列与目前已报道的四类与甲氧基取代芳烃降解有关的脱甲基酶进行比对:细胞色素P450类（以CYP51A1为例）、Rieske非血红素铁氧化酶类（以DMO为例）、来自好氧细菌的四氢叶酸依赖型脱甲基酶（以DesA为例）和来自厌氧细菌的四氢叶酸依赖型脱甲基酶（以MtvB为例）。Dot plot比对结果表明该菌基因组中没有与细胞色素P450、Rieske非血红素铁氧化酶和MtvB有相似性的基因序列,但发现位于scaffold 02、scaffold 50和scaffold 66上分别有一段序列和四氢叶酸依赖型脱甲基酶DesA有一定的相似性。在这三个scaffold上分别有1个疑似脱甲基酶基因（dmt）和3个与四氢叶酸代谢相关的基因:mthfr（编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶）、mthc（编码甲酰基四氢叶酸脱甲酰酶）和dhc（编码一个双功能酶:5,10-次甲基四氢叶酸脱氢酶和5,10-次甲基四氢叶酸环化酶）。这3个疑似脱甲基酶在氨基酸序列上与Sphingmonas paucimobilis SYK-6中催化香草酸（vanillate）和丁香酸（syringate）脱甲基的脱甲基酶LigM和DesA同源性分别为42-46%和43-45%。分别将包含这三个疑似脱甲基酶基因的片段克隆连接到广宿主载体pBBRlMCS2上,利用三亲接合导入不能降解麦草畏的Sphingomonassp.DC-6中,全细胞降解试验结果表明,导入来自scaffold 50和scaffold 66片段脱甲基酶基因的重组子获得了降解麦草畏的能力,说明scaffold 50和scaffold 66上的脱甲基酶基因编码的脱甲基酶具有麦草畏降解活性,分别命名为dmt50和dmt66,而且同时导入脱甲基酶基因及连锁的三个与THF代谢相关酶的基因mthfr、mthc和dhc的重组子降解效率要比仅导入脱甲基酶基因的重组子高得多,说明麦草畏脱甲基过程需要mthfr、mthc和dhc和的参与。实时荧光定量PCR表明scaffold 50和scaffold 66上dmt、mthfr、mthc和dhc均不受底物麦草畏的诱导,其表达是组成型的。二、Ndbn-20中脱甲基酶Dmt50和Dmt66的表达、纯化和酶学特性研究分别将上述的三个脱甲基酶基因连接到表达载体pET 29a（+）上,并导入E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达,并通过亲和层析对表达产物进行了纯化。酶学结果表明Dmt50和Dmt66在在四氢叶酸存在时催化麦草畏脱甲基形成DCSA,同时生成5-甲基四氢叶酸,而位于scaffold 02上的脱甲基酶则没有麦草畏脱甲基酶活力。Dmt50和Dmt66在pH 8.0,30℃时麦草畏脱甲基酶活分别为72±5 nmol-1imin-1 mg和63±7 nmol-1min-1mg。Dmt66的最适反应温度在30-40℃之间,最适pH 6.5-8.5之间。Na+、Li+、Fe2+、K+和Mg2+对酶的活力没有明显影响,Ca2+、Mn2+、Cr3+和Co2+对酶有一定的抑制作用,Zn2+、Ag+、Pb2+、Hg+和Ni2+强烈抑制酶的活力,加入EDTA对酶活没有影响表明Dmt催化麦草畏脱甲基时不需要其他金属离子。Dmt66的催化活力受到产物5-methyl-THF的反馈抑制。三、scaffold 66上5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因mthfr66表达和功能初步研究将位于scaffold 66上编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的基因mthfr66克隆到pET 29a（+）表达系统进行表达,并通过亲和层析纯化。酶活测定结果表明纯化的Mthfr66具有5-methyl-THF氧化还原酶活性。Mthfr66的最适反应温度在30-40℃之间,最适pH6.5-8.5之间。Na+、Li+、Fe2+、K+和Mg2+对酶的活力没有明显影响,Ca2+、Mn2+、Cr3+和Co2+对酶有一定的抑制作用,Zn2+、Ag+、Pb2+、Hg+和Ni2+强烈抑制酶的活力。另外,将 Mthfr66 与分别来自 Sphingobium quisquiliarum DC-2、Sphingobium jiangsuense BA-3和Escherichiacoli K-12中的四个Mthfr进行功能比较,发现这四个Mthfr需要甲萘酰作为电子受体、FAD为辅因子才可催化5-methyl-THF转变成THF,而Mthfr66不需要甲萘醌和FAD也有此活性。