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RNA干扰（RNAi）技术自问世以来,被广泛应用于害虫防治领域中,是一种非常有前景的抗虫策略。针对害虫靶标基因的外源dsRNA被害虫取食后,害虫靶标基因下调,导致害虫生长发育迟缓甚至死亡,最终达到防治目的。但是dsRNA的递送方式、长度,序列和浓度等因素都会影响RNAi的效率。目前,通过植物介导RNAi抗虫在农业生物技术领域也展现出巨大的潜力,而且由于植物质体中缺乏RNAi机制使得dsRNA在其中能稳定积累,具有更强的杀虫效果。马铃薯甲虫是一种国际上公认的马铃薯毁灭性的检疫害虫,上世纪末入侵到中国新疆等地区,对我国马铃薯产业也造成了巨大的危害和损失。前期研究结果显示,该虫对于RNAi比较敏感,通过植物质体介导RNAi抗马铃薯甲虫的策略是有效可行的,但是在这个过程中影响马铃薯甲虫RNAi效率的因素并不清楚。本研究主要探讨dsRNA的长度,dsRNA靶向同一mRNA不同位置以及dsRNA与mRNA的错配率对马铃薯甲虫体内RNAi效率的影响。研究内容包括在体外合成不同长度、具有不同序列的、带有不同突变率dsRNA对马铃薯甲虫进行喂食,然后在马铃薯质体中表达不同长度dsRNA,分析不同长度dsRNA在质体中积累量的差异,及其对马铃薯甲虫杀虫效果的影响。为质体介导RNAi抗虫过程中针对靶标基因的dsRNA设计提供参考和理论依据。主要研究结果如下:1)dsRNA的长度会影响RNAi效率。通过在体外设计不同长度的dsRNA进行喂食实验时发现,与喂食60 bp的dsRNA相比,喂食dsRNA的长度为200 bp及以上时,马铃薯甲虫的RNAi效率更高。然而,当dsRNA的长度在200-700 bp之间时,比较喂食后马铃薯甲虫的存活率、体重变化和基因下调水平没有显著性差别,这表明长度在此区间内的dsRNA所引发的RNAi效率没有显著的差异。不同长度的dsRNAs在体外RNAi效率依次为ds ACT60<ds ACT200≈ds ACT297≈ds ACT400≈ds ACT700。2)dsRNA靶向基因不同位置会影响RNAi效率。通过体外设计针对同一靶标基因的不同位置序列的dsRNA进行喂食时发现,喂食不同序列dsRNA后马铃薯甲虫的存活率出现显著性差异,这表明选择不同靶标位置会影响RNAi效率。分析比较不同序列中潜在的有效siRNA位点发现,其中包含siRNA位点较少的序列所引起的RNAi效率会低于其他位置。3)dsRNA与靶标mRNA之间的错配率低于3%时,对RNAi的效率无显著性影响。通过体外设计并合成不同突变率的dsRNA进行喂食,比较dsRNA突变序列和dsRNA原始序列喂食后马铃薯甲虫的存活率、体重变化和基因下调水平发现均无显著性差异,这些结果表明当dsRNA与靶标mRNA的错配率不超过3%时,并不影响马铃薯甲虫体内RNAi的效率。4)dsRNA的长度会影响在质体中的积累量进而影响抗虫效果。在质体中表达不同长度的dsRNA,通过Northern检测其在质体中的积累量时发现当dsRNA长度在200-700 bp时,随着dsRNA长度的增加在质体中的积累量反而减少,积累量从低到高依次为St-ACT700<St-ACT400<St-ACT297<St-ACT200,其中St-ACT200植株中dsRNA的积累水平约占总RNA的0.6%。将表达不同长度的dsRNA的转质体植物对马铃薯甲虫进行喂食实验时发现,其抗虫效果与其在质体中dsRNA的积累水平呈正相关,dsRNA积累水平越高,对马铃薯甲虫的杀虫效果更好,抗虫效果依次为St-ACT700<StACT400<St-ACT297<St-ACT200。综上所述,我们发现dsRNA分子对RNAi抗马铃薯甲虫效率的一些影响因素,并通过在质体介导RNAi中进行运用,将长度为200-700 bp的dsRNA在马铃薯质体中进行了表达,发现dsRNA的积累量依赖长度而变化,长度越长,积累量越低,抗虫效果越弱,为后续通过质体介导RNAi抗虫的设计奠定了基础,提供了新的思路。