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在昆虫病原线虫-共生菌复合体对寄主昆虫致病的过程中,共生菌是关键的致病因子。共生菌寄存于昆虫病原线虫的肠道内,二者互惠共生。目前已发现的昆虫病原线虫共生菌均为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌,共有3类:嗜线虫沙雷氏茵(Serratia nematodiphila)、发光杆菌(Photorhabdus)和致病杆菌(Xenorhabdus);分别与拟异小杆属(Heterorhabditidoides)、异小杆科(Heterorhabditidae)和斯氏线虫科(Steinemematidae)线虫共生。Serratia nematodiphila R187-2是本实验室从江苏如皋发现的昆虫病原线虫新种拟异小杆线虫(Heterorhabditidoides rugaoensisn.sp.RG081015)中分离到的高毒力菌株。前期研究发现R187-2分泌的胞外蛋白酶HS487是该菌株的主要杀虫活性成分,对鳞翅目、双翅目和鞘翅目部分害虫具有较强的毒杀作用。本文通过设计引物扩增了 HS487的编码基因,其序列长度为1464bp,并利用分子生物学等手段成功构建了该蛋白的原核表达系统。重组菌株发酵后,菌体细胞经超声波破碎、SDS-PAGE电泳发现目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。为了提高目的蛋白的可溶性,对诱导表达条件进行优化,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.2 mM,诱导温度30℃,诱导时间3 h。目的蛋白依旧以包涵体形式存在,因此对该包涵体蛋白通过洗涤、尿素溶解、Ni2+亲和柱分离纯化和梯度透析等过程进行纯化复性。纯化后的重组蛋白对大蜡螟老热幼虫的血腔毒力半致死剂量(LD50)为2.71(2.29-3.16)ng·mg-1表明包涵体蛋白复性成功且具有很强的杀虫活性。为进一步鉴定杀虫基因hs487的功能,我们将R187-2的杀虫基因hs487进行插入突变,采用双亲本杂交的方法,成功构建了 R187-2的突变菌株HS487S。通过针扎感染的方式,让R187-2的突变菌株和野生菌株感染野生型、Dredd突变体、GNBP1突变体的果蝇,观察统计果蝇的死亡情况,并采用荧光定量PCR的方法,检测果蝇体内两种抗菌肽Diptericin和Drosomycin的表达水平。结果表明,突变株感染的此三类果蝇体内两种抗菌肽表达量明显比R187-2感染的低;果蝇对突变株的免疫应答反应相对R187-2较迟缓;突变株对果蝇的杀虫活性也明显降低,果蝇存活时间较长。可见,杀虫基因hs487被突变后,R187-2的杀虫活性明显降低,证明了杀虫蛋白HS487是昆虫病原线虫共生菌R187-2的关键毒力因子。本研究为进一步探究杀虫毒素HS487的功能奠定了理论基础,为杀虫毒素HS487的开发利用提供了重要的理论依据。