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人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是一类嗜上皮组织的双链闭合小DNA病毒，目前已发现一百余种亚型。HPV感染可引起人类的多种良、恶性疾病，现已证明持续感染高危型α-HPV可引起宫颈癌，大量临床资料和研究表明β-HPV感染与非黑素瘤性皮肤肿瘤（nonmelanoma skin cancer, NMSC）的发病密切相关。尽管与黑素瘤相比，NMSC很少发生转移，致死率低，但近年来在全球范围内NMSC发病率逐年上升，给社会造成了巨大的医疗负担，因其多发生在颜面等光暴露部位也给患者带来了沉重的身心压力。因此，对其发病机制的研究备受科学家的关注，研究者发现NMSC发病除了与紫外线（ultraviolet ray, UV）照射、人种、年龄、地域、免疫抑制等因素相关外，还与β-HPV感染关系密切。细胞自噬是一种普遍存在于真核细胞中的保护性机制。细胞自噬通过形成自噬溶酶体来清除失去功能、变性和受损的细胞器、大分子物质和蛋白质等，与人类的多种疾病发生密切相关如衰老、神经退行性变、恶性肿瘤、病原微生物感染等。细胞自噬和肿瘤关系目前还存在很大的争议，这可能与自噬具有抑制和促进肿瘤的双重作用相关。自噬在肿瘤的发生阶段，可以防止细胞恶变，发挥抑制肿瘤作用；在肿瘤形成阶段，自噬又能为肿瘤提供能量，增强肿瘤细胞的生存能力。研究认为自噬在抗病毒的活动中具有双面性，一方面，当病毒入侵机体时，自噬通过协助固有免疫及适应性免疫，抵抗病毒感染；另一方面，细胞自噬又被某些病毒所利用，为病毒复制、转录提供场所和能量，有利于病毒持续感染。目前，β-HPV确切的致病机理及有无致病的高危亚型仍不清楚，有关β-HPV与细胞自噬在NMSC发病中的作用未见报道。为此，本课题组前期的研究内容之一是了解我国与NMSC发生密切相关的高危β-HPV亚型，并探索β-HPV在NMSC发病中的分子机制。结果表明：HPV38是与光线性角化病(actinic keratosis,AK)和鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）发病最为密切的亚型；利用透射电镜观察和免疫组化的方法发现，HPV38阳性的SCC组织中细胞自噬水平明显增高，提示细胞自噬可能在NMSC发病中起着重要的作用，HPV38可能通过调节细胞自噬发挥其致癌作用，那么在细胞水平上，HPV38对细胞自噬的影响是什么？其作用的分子机制又是什么？这些都是尚需研究的问题。方法本研究以人永生化HaCaT细胞为研究对象，首先建立HPV38E6/E7过表达的稳定转染细胞株，为研究构建细胞模型；其次利用CCK-8、平板克隆形成实验、流式细胞术检测HPV38E6/E7对细胞生物学功能的影响，及Western blot法、透射电镜观察细胞自噬水平，并检测自噬对细胞增殖、凋亡的影响；最后，探讨HPV38E6/E7诱导细胞自噬发生的分子机制。主要结果1. HPV38E6/E7质粒经转化、扩增、抽提后，以及XbaⅠ/Bam HI双酶切鉴定，结果显示所购质粒确实含有HPV38E6/E7目的片段，利用脂质体法成功将质粒转染入人永生化HaCaT细胞，并构建稳定表达HaCaT-pGCMV细胞和HaCaT-HPV38E6/E7细胞株；2. CCK-8和平板克隆形成实验结果显示：转染HPV38E6/E7后细胞增殖活力明显升高；采用Annexin V/PI法检测细胞凋亡，重复多次发现：HaCaT-pGCMV细胞凋亡率水平高于HaCaT-HPV38E6/E7细胞，差异具有统计学意义（P<0.05）；流式细胞术细胞计数检测细胞周期发现：HaCaT-HPV38E6/E7细胞S期细胞比例高于HaCaT-pGCMV细胞，结果具有统计学差异（P<0.05）；3. Western blot法检测细胞自噬特异性蛋白表达水平，结果显示：与HaCaT-pGCMV细胞相比，HaCaT-HPV38E6/E7细胞Beclin1、LC3表达水平明显升高，p62表达则下降，同样利用透射电镜观察发现：HaCaT-HPV38E6/E7细胞中自噬小体的数目明显高于HaCaT-pGCMV细胞（P<0.05）；4. Western blot结果发现：加入细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）后，HaCaT-HPV38E6/E7细胞自噬活力明显下降；CCK-8检测显示：加入3-MA后，HaCaT-HPV38E6/E7细胞增殖受到抑制，与对照组相比未见明显差异（P>0.05）。流式细胞术检测细胞凋亡结果发现：与对照组细胞相比，HPV38E6/E7可以降低细胞凋亡，抑制该细胞自噬后，则细胞凋亡明显升高，结果具有统计学意义（P<0.05）；5. Westerm blot法检测结果显示：与HaCaT-pGCMV细胞相比，HaCaT-HPV38E6/E7细胞中p-PKRThr451、p-eIF2αSer51蛋白表达水平明显升高；加入PKR磷酸化抑制剂2-氨基嘌呤（2-AP）后，同样采用Westerm blot法检测发现，2-AP成功抑制了PKR磷酸化后，p-eIF2αSer51水平随之降低，自噬特异标记蛋白Beclin1、LC3表达水平明显下降，2-AP浓度为5mmol/L时作用更明显。主要结论1. HPV38E6/E7改变细胞周期，使S期细胞数增多，引起细胞明显增殖，克隆形成能力增强，并且能够显著抑制细胞凋亡发生；2. HPV38E6/E7能够引起细胞自噬水平明显增高，为快速增殖提供能量和原料，这可能是其生物学功能之一，相反抑制细胞自噬水平则会引起细胞增殖减少，细胞凋亡增加，提示HPV38E6/E7可能通过细胞自噬影响细胞增殖、凋亡；3. HPV38E6/E7通过PKR/eIF2a信号转导通路诱导细胞自噬发生，发挥生物学功能。