论文部分内容阅读
前言:
苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)是多环芳烃(Polycylic AromaticHydrocarbons，PAHs)类化合物的典型代表，广泛存在于生产和生活环境中，主要在有机物如燃煤、燃气、炼焦、垃圾焚烧等的高温裂解过程中产生，其进入机体后经肝微粒体酶活化系统，形成终致癌产物反式二氢二醇环氧苯并[a]芘(7，8-dihydrodiol9，10-epoxide benzo[a]pyrene，BPDE)，能与DNA结合形成加合物，在代谢过程中产生的大量活性氧(ROS)也可造成DNA的损伤，从而诱发皮肤癌、肺癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌等多种癌症。
肿瘤是细胞分化、增殖和死亡机制发生异常的结果。DNA的损伤和基因结构的异常以及由此造成的癌基因和抑癌基因表达或功能上的改变是细胞恶性转化的必要前提。人类细胞基因组DNA受到损伤后，首先通过对损伤的感知和识别，经过某种信号的转导，产生以下效应:DNA修复，旁路复制(translesion replication)以及凋亡(apoptosis)。研究表明DNA损伤修复能力的个体差异是决定肿瘤易感性的重要因素，而个体DNA损伤修复能力与DNA修复基因的单核苷酸多态(Singlenucleotide polymorphisms，SNP)密切相关。核苷酸切除修复交叉互补基因2，又称着色性干皮病基因D(Excision repair cross complementation group2/xerodermapigmentosum group D，ERCC2/XPD)位于人类染色体19q13.3，是一种进化保守的ATP依赖性DNA解旋酶，在NER途径中起着重要作用。现已发现ERCC2/XPD的编码区存在6个SNPs位点，分别为密码子156 C→A、199 C→T、201 C→T、312 G→A、711 C→T、751 A→C，其中751位点的多态性与肿瘤发生的易感性是近几年来流行病学研究的热点。
ERCC2/XPD751位点的A→C碱基突变导致相应的Lys→Gln氨基酸的改变。该密码子位于ERCC2/XPD蛋白N端，保守性差。有研究显示，携带ERCC2/XPD751Gln变异等位基因的个体NER能力明显下降，且密码子751位点野生型纯合子个体的DNA修复能力高于杂合子和突变型纯合子的个体，提示ERCC2/XPD基因密码子751位点的突变与DNA损伤修复能力密切相关，从而影响个体对多种肿瘤的遗传易感性。但以人群为基础的流行病学研究结果存在的不一致性，提示我们需要标化研究环境因素的暴露，以探讨基因-环境间的交互作用。
本研究通过构建ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位点不同基因型的质粒，转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)突变型UV5(ERCC2/XPD表达缺失)，获得稳定表达ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位点不同基因型的转染细胞系，明确施加环境致癌因子苯并[a]芘后，比较ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位点不同基因型DNA损伤修复能力的差异以及对ERCC2/XPD转录水平、蛋白表达水平的影响，与前期人群研究结果相结合，试图为找寻意义明确的环境致癌因子相关肿瘤的遗传易感性生物标志提供理论依据。
研究方法:
1、细胞培养及处理
中国仓鼠卵巢细胞(CHO) AA8(CHO野生型)、UV5(CHO突变型，ERCC2/XPD表达缺失)用含10％ FBS、10 IU/ml青霉素、10 IU/ml链霉素的DMEM培养基，置于37℃，5％ CO2孵育箱中培养。用不同浓度B[a]P处理，并加入S9混合液（体积比为3％）。B[a]P溶于DMSO中，各组DMSO的终浓度均低于0.1％。S9混合液的组分包括:S9（体积分数为10％）、33 mmol KCl、8mmolMgCl2·6H2O、5 mmol6-磷酸葡萄糖(G-6-P，C6H11O9PNa2)、4mmol NADP(辅酶Ⅱ)、0.1 mol Na2HPO4～NaH2PO4(pH7.4)。
2、体外转染细胞模型的构建
2.1 Gateway定向克隆法构建包含ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位点不同基因型的质粒由荷兰莱顿大学医学研究中心完成，并馈赠本课题组。
2.2采用invitrogen Lipofectamine~2000转染试剂盒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)突变型UV5(ERCC2/XPD表达缺失)，获得稳定表达ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)位点不同基因型的转染细胞系。
2.3转染细胞系的鉴定:Western blotting检测ERCC2/XPD基因蛋白表达、TaqMan(㊣) real-time PCR法检测ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181)位点基因型。
3、各细胞系DNA损伤修复能力的检测
3.1细胞抑制率实验(MTT)测定B[a]P处理后细胞存活率;
3.2彗星实验和Rad51免疫荧光实验测定B[a]P所致DNA的损伤情况;
3.3各细胞系DNA损伤修复能力差异的比较。
4、ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181) SNP功能差异的可能机制
4.1 Real-time PCR测定B[a]P染毒后ERCC2/XPD mRNA水平;
4.2 Western blotting测定B[a]P染毒后ERCC2/XPD蛋白表达水平;
4.3在转录和蛋白水平上分析比较表达ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181)位点不同基因型的转染细胞系之间的差异。
结果:
1、体外转染细胞模型构建成功
1.1 ERCC2/XPD rs13181 AA(Lys751)、rs13181 CC(Gln751)和GFP质粒分别同时转化感受态大肠杆菌(E.coli DH5α)，可选择生长于含卡那霉素的LB琼脂平板。对提纯的质粒进行测序，ERCC2/XPD序列正确无误。
1.2 ERCC2/XPD rs13181 AA(Lys751)、rs13181 CC(Gln751)和GFP质粒分别同时转染UV5细胞，转染细胞可在含0.5-1 mg/ml G418的DMEM培养基中选择性生长。五日后，荧光显微镜下可见表达绿色荧光蛋白的转染细胞，转染效率均达到80％以上。
1.3 Western blot鉴定ERCC2/XPD基因在各细胞中的表达，两种转染细胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)可表达分子量为87 kD的ERCC2/XPD蛋白，证实细胞转染成功。
1.4 TaqMan(㊣) real-time PCR法验证转染细胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)的ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181)位点不同基因型，分别为AA和CC。
2、各细胞系DNA损伤修复能力差异的比较
2.1 MTT实验结果显示ERCC2/XPD缺失型细胞(UV5和UV5GFP)与野生型AA8相比，对B[a]P表现出较强的敏感性。而ERCC2/XPD过表达转染细胞则表现出与AA8相似的细胞抑制率。对于转染细胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)在B[a]P处理24 h时，各浓度的细胞存活率并无明显的差异，但是经过24 h的恢复，5、10、25、50μM B[a]P处理时UV5ERCC2(CC)的细胞存活率明显低于UV5ERCC2(AA)，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.2彗星实验结果显示ERCC2/XPD过表达可以使DNA损伤修复能力增强。在B[a]P处理6h和12h时，除10μM B[a]P处理6h外，两种转染细胞间差异有统计学意义(方差分析，LSD，P＜0.05)，说明不同基因型在BPDE-DNA加合物形成的高峰期，对DNA损伤修复能力是有影响的。
2.3 Rad51免疫荧光实验FOCI不仅代表着DNA损伤中心，还是同源重组(homologous recombination，HR)启动的标志之一。结果同样验证了ERCC2/XPD过表达可以使DNA损伤修复能力增强。但是两种转染细胞间FOCI的数量并无显著性差异。
3、ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181) SNP功能差异的机制探讨
3.1 Real-time PCR实验结果显示B[a]P处理6h时，ERCC2/XPD的mRNA水平达到高峰，随着染毒时间的延长，ERCC2/XPD的mRNA水平逐渐呈下降趋势。在5μM B[a]P处理12h时，UV5ERCC2(AA)的ERCC2/XPD mRNA表达水平明显高于UV5 ERCC2(CC)，差异有统计学意义（P＜0.05）。
3.2 Western blot实验结果显示B[a]P处理6h时，ERCC2/XPD的蛋白表达水平达到峰值并且持续到12 h。在5μM B[a]P处理12 h时，UV5ERCC2(AA)的ERCC2/XPD蛋白表达水平明显高于UV5ERCC2(CC)，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:
1、本研究通过获得稳定表达ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位点不同基因型的转染细胞系，为体外研究ERCC2/XPD基因多态构建了实验技术平台。
2、本研究发现ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181) SNP在苯并[a]芘所致DNA损伤修复能力方面存在差异，该位点AA基因型转染细胞的损伤修复能力明显优于其突变型CC基因型。因此ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181) SNP可能与环境致癌因子所致DNA损伤修复能力差异相关联。
3、在一定浓度苯并[a]芘所致DNA损伤的高峰期，ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181) AA基因型转染细胞的ERCC2/XPD mRNA水平和蛋白表达水平高于其突变型CC基因型。因此可能成为解释该位点SNP DNA损伤修复能力存在差异的重要原因。