几种含半胱氨酸的小分子功能肽的研究与应用

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半胱氨酸(Cysteine,Cys)是生物体内一种常见的含有游离巯基的氨基酸,可转化成胱氨酸。存在于许多蛋白质(如铁硫蛋白(Iron-sulphur protein)、金属硫蛋白(Metallothionein,MT),)和小分子功能肽中,如谷胱甘肽(glutathione,GSH)和奥曲肽(octreotide,Oc)等。半胱氨酸及其衍生物正是由于含有游离巯基而具有多种生理功能,如具有抱合作用;可有效地预防和治疗放射性伤害;在皮肤蛋白的角蛋白生成中维持重要的琉基酶的活性,并且补充巯基,以维持皮肤的正常代谢;具有防止生物体衰老的功能,可强化生物体自身的防卫能力、调整生物体的防御机构。基于半胱氨酸和其衍生物具有独特的生理功能,开展了谷胱甘肽、奥曲肽和铁硫蛋白等含有半胱氨酸的功能肽研究,论文的主要工作有:   (1)以谷胱甘肽GSH为配体,Ce(Ⅳ)盐为中心配位离子,利用Ce(Ⅳ)的氧化作用,将谷胱甘肽的巯基氧化成二硫键,而Ce(Ⅳ)被还原成Ce(Ⅲ),生成Ce(Ⅲ)与氧化性谷胱甘肽(GSSG)的配合物Ce(Ⅲ)-(GSSG),并对配位机理进行了初步探讨,主要是羧基上的氧参与了配位;对比Ce(Ⅳ)的荧光特性,配合物能够发出特征荧光λem=350 nm(λex=255 nm),而且单色性好、发光强度高。   (2)利用Ce(Ⅳ)和巯基化合物(RSH)发生氧化还原和配位作用,形成的配合物Ce(Ⅲ)-RSSR具有明显荧光这一特性,将其作为荧光探针。通过荧光光谱法根据Ce(Ⅲ)-RSSR化合物荧光强度随着巯基化合物的浓度变化而变化,从而确定生物体内巯基化合物的浓度。此方法简单、快捷、灵敏,GSH和Cys的检测限分别为0.05和0.08 nmol·L-1。可将此方法用于实际样品中GSH的检测,如用这一方法测定猪肝中总游离巯基化合物的量在4.64和4.74μmol·g-1之间,而且回收率在100.6%和102.3%之间,与文献报道值非常接近。   (3)采用化学沉淀法合成磁性纳米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs),用羧甲基化的葡聚糖(carboxymethyl-dextran,CMD)对纳米粒子进行改性。实验结果表明经过表面改性后的磁性纳米粒子呈球形,分散均匀,平均粒径为30 nm;同时磁性复合纳米粒子仍保持MNPs的晶相结构,并且在水溶液中的稳定性和分散性有很大的提高,水溶胶相对吸光值在静置12 h后由MNPs的30提高到98,磁性复合纳米粒子具有超顺磁性,其饱和磁化强度为35 emu·g-1,可作为磁共振成像造影剂。用羧甲基葡聚糖改性后的复合磁性纳米粒子来固定奥曲肽(octreotide,Oc),得到药物磁性纳米粒子(CMD-MNPs-Oc),药物奥曲肽可以将MNPs颗粒在特异性,靶向性的作用下引入生长抑素受体阳性细胞(Bx-PC3)内,并使其在磁共振成像(magneticresonance imaging,MRI)检测中具有同生长抑素受体阴性细胞明显的信号差异。   (4)将铁硫簇配体半胱氨酸(Cysteine,Cys)和组氨酸(Histidine,His),采用液相合成法合成小分子二肽Fmoc-Cys(Trt)-His-OMe和三肽Fmoc-Cys(Trt)-Cys(Trt)-His-OMe,脱除Fmoc保护基团后再偶联二茂铁(ferrocene,Fc)的环上,合成了8种的二茂铁半胱氨酸及衍生物,分别是3a:Fe[C5H4-CO-Cys(Trt)-OMe][C5H4-CO-piperidine],3b:Fe[C5H4-CO-Cys(Trt)-His-OMe][C5H4-CO-piperidine],3c:Fe[C5H4-CO-Cys(Trt)一Cys(Trt)-His-OMe][C5H4-CO-piperidine],3d:Fe[C5H4-CO-Cys-OMe][C5H4-CO-piperidine],4:Fe[C5H4-CO-Cys(Trt)-OMe][C5H4-CO-OMe],5:Fe[C5H4-CO-Cys(Trt)-OMe]2,6a:Fe[C5H4-CO-Cys(Trt)-His-OMe]2,6b:Fe[C5H4-CO-Cys(Bzl)-His-OMe]2,采用核磁共振氢谱、碳谱(1H,13C-NMR)、质谱(MS)和元素分析(Elemental analysis)对化合物进行表征。并通过循环伏安(Cyclic Voltammetry,CV)和圆二色谱(Circular Dichroism,CD)方法,研究这类铁硫簇类似物的电子传递性质以及和金属离子作用前后的空间构型变化。电化学结果表明此类化合物均为单电子传递,在溶液中电化学行为都为扩散控制,半波电位在690到860 mV之间,电位差几乎都低于100 mV;圆二色谱结果表明所有化合物在溶液中都是以P-螺旋构型存在。与金属离子相互作用结果发现,Zn(Ⅱ)能够脱除巯基上的保护基团trityl(Trt),但不能脱除benzyl(Bzl)保护基团,脱除保护基团后在Cys和His残基同时存在的情况下和金属离子进行了配位,形成了铁硫簇类似物,其电化学信号和构型都发生了变化,由P-螺旋变为M-螺旋。
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