结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的一种慢性传染病。巨噬细胞是Mtb的主要靶细胞,可通过自噬、凋亡等途径清除Mtb,而Mtb也会通过多种机制逃避宿主细胞的杀伤作用。外泌体在细胞间信息交流中起着至关重要的作用,外泌体来源的因子可以直接影响基因的转录和翻译,通过影响信号传递改变蛋白修饰,调节蛋白定位和关键的酶催化反应,进而调控受体细胞的生理活动。为了探究上皮细胞来源的外泌体对BCG感染巨噬细胞后免疫反应的调控作用及机制,本研究通过提取BCG感染和未感染的上皮细胞来源的外泌体并进行鉴定,再将其作用于BCG感染的巨噬细胞,利用蛋白免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术等技术,从形态学及分子水平对巨噬细胞炎症、凋亡及自噬进行检测,来揭示外泌体在巨噬细胞感染结核分枝杆菌中的调控作用,并且进一步用雷帕霉素(Rapamycin,rapa)来探究外泌体对自噬的调控作用是否依赖于mTOR通路。实验结果如下:1.纯化获得的上皮细胞的外泌体在透射电镜下呈圆盘状,大小在30～150nm;表达外泌体表面分子标志CD81、CD63、HSP70;DIR红色染料标记的外泌体被巨噬细胞吞噬进入胞内;加入浓度为50μg/mLBCG感染或未感染的上皮细胞来源的外泌体能够显著上调TLR信号分子TLR2、TLR4、TLR6的表达(p<0.05),促进细胞炎症因子IL-6、IL-1β的分泌;同时促进MyD88、NF-KB、TRAF6蛋白的表达,说明上皮细胞来源的外泌体可促进BCG诱导的巨噬细胞的炎症反应。2.BCG感染和未感染的上皮细胞来源的外泌体均可极显著提高巨噬细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase3的表达(p<0.01),提高细胞凋亡率降低存活率:BCG感染巨噬细胞后,BCG感染来源的外泌体与正常外泌体比较,可下调凋亡相关蛋白Bax、Caspase3的表达,降低巨噬细胞的凋亡率。3.BCG感染巨噬细胞12h时Beclin1、Atg7、LC3蛋白表达量最高。两种来源的的外泌体刺激BCG感染的巨噬细胞后,自噬相关蛋白Beclin1、Atg7、LC3的表达量升高;而BCG感染上皮细胞来源的外泌体对BCG感染巨噬细胞后自噬相关蛋白的上调作用弱于正常外泌体,抑制自噬流的形成;同时外泌体可上调mTOR通路相关蛋白p-AKT、AKT、P-mTOR、mTOR、PI3K的表达,说明两种来源外泌体均可促进BCG诱导的巨噬细胞自噬,而BCG感染上皮细胞来源的外泌体对BCG诱导的巨噬细胞自噬的增强作用弱于正常外泌体。4.加入mTOR抑制剂雷帕霉素,与正常外泌体比较,BCG感染上皮细胞来源的外泌体上调巨噬细胞中LC3、Atg7、Beclinl蛋白的表达,表明雷帕霉素可逆转BCG感染上皮细胞来源外泌体对自噬相关蛋白的抑制作用;同时雷帕霉素下调P-AKT、P-mTOR、mTOR蛋白的表达,逆转BCG感染上皮细胞来源的外泌体对巨噬细胞mTOR相关蛋白的促进作用,说明上皮细胞来源的外泌体可通过mTOR通路参与对BCG诱导的巨噬细胞自噬的调控作用。综上,外泌体可促进巨噬细胞的炎症反应,正常上皮细胞外泌体可上调BCG感染后巨噬细胞的凋亡及自噬,BCG感染的外泌体对巨噬细胞的凋亡及自噬的增强作用弱于正常外泌体,且两种外泌体对自噬的调控作用依赖于mTOR信号通路。表明上皮细胞来源的外泌体可通过调控巨噬细胞的炎症、凋亡及自噬,参与对BCG感染的巨噬细胞免疫反应的调控。