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原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是目前转基因鸡研究的主要宿主细胞。PGCs是精子和卵子的前体细胞,起源于胚盘的上胚层,经生殖新月,内外血液循环系统迁移,最后到达生殖原基,发育成精子或卵子。为了探讨转座子介导法制备转基因鸡效率,本研究将自行构建的转座子载体和转座酶表达载体注射HH13-14时期鸡胚,进行体内转染PGCs,通过检测报告基因EGFP表达效率,比较不同转座子及特异调控元件基因转移效率。获得以下研究结果。1、将转座子载体pT3-PST-CAG-GFP与PB/SB/To12转座酶以2:1的质量比混合均匀,注射HH10鸡胚胚体。通过检测ED14鸡胚EGFP表达水平,比较三种转座子性腺PGC基因转移效率。实验分五组:PB组、SB组、Tp12组、开窗对照组和不开窗对照组。结果表明,各组成活率差异不显著(P>0.05);PB、SB、Tol2三种转座子在鸡胚上均具有较高转基因效率,可介导EGFP在鸡胚生殖腺、肠、胃、脑等组织器官表达,三组转基因效率差异不显著(P>0.05);其中SB组性腺阳性率高于PB组,但差异不显著(P>0.05)。TO12组未获得阳性生殖腺。2、通过高保真PCR法克隆PGCs特异表达启动子PSP、SV40Enhancer、SB100X编码框,经序列测定和比对,与原序列同源性达到100%。利用DNA重组方法成功构建了 PGCs特异表达载体pSV40En-PSP-GFP和pSV40En-PSP-SB100X。为了优化基因包埋剂,将pSV40En-PSP-GFP分别用Lip2000CD和多聚阳离子PEI包裹,注射至HH13-14期鸡胚血管。结果表明Lip2000CD和PEI对整体转基因效率影响不显著(P>0.05),但PEI组性腺阳性率(6.67%)略高于Lip2000CD组(2.47%);为了检测PGCs特异表达启动子PSP表达特性,将 pT3-PST-CAG-GFP 和 pSV40En-PSP-SB100X 或 pCMV-SB 100X 以 2:1 的质量比混匀,注射至HH13-14期鸡胚血管。结果表明,PSP组性腺阳性率(11.03%)高于CMV启动子组(1.67%),且PSP驱动EGFP在性腺特异表达,表达显著高于CMV。3、通过高保真PCR法克隆得到鸡Nanos3’UTR、EGFP编码框,经序列测定和比对,与目标序列同源性达到100%。利用DNA重组方法成功构建了体外转录载体pTNT-GFP-Nanos 和 pTNT-SB100X-Nanos。为 了检测 Nanos 3’UTR 生物学特性,将pT3-PST-CAG-GFP 和 SB100X-Nanos RNA 或 SB100X RNA 共注射至 HH13-14 期鸡胚血管中。初步结果表明ED14鸡胚生殖腺、肝、心、脾等器官均有EGFP表达,说明Nanos 3’UTR指导外源基因富集于生殖细胞的特性不显著。综上所述,本研究成功构建了含PGCs特异元件的转座子载体pSV40En-PSP-SB100X/pTNT-SB100X-Nanos。通过鸡胚血管注射发现,PSP元件介导的转座子载体在PGCs中特异表达,有效提高了 PGC转基因效率。为后期转基因鸡生物反应器的研制鉴定了坚实的基础。