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抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是大多数生物体先天性免疫系统的重要组成部分,是生物体经过诱导产生的一类具有抗菌活性的小肽类物质,可在生物体中有效杀灭病原菌以及抵御外来细菌和病毒的入侵。天蚕素AD为天蚕素抗菌肽的一种,天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,因此实现其工业化生产可为其在农业、养殖业中的应用奠定基础。本研究分别使用AOX启动子和GAP启动子构建出诱导型基因工程菌株和组成型基因工程菌株,通过对其抑菌能力的检测以及菌株的遗传稳定性的观察,最终选用组成型表达菌株作为后续实验菌株。基于以上研究对天蚕素AD在毕赤酵母中的高效表达以及发酵条件进行了优化,并对其特性进行了检测。本研究为抗菌肽利用基因工程在毕赤酵母中成功表达并应用于养殖业、食品及医疗行业提供了科学数据及技术支持。主要实验结果如下:1.本文全基因合成天蚕素AD基因片段,利用引物扩增出带有Xho I和Not I位点的天蚕素AD基因,将其与同样双酶切的载体pPIC9K连接,将其转入大肠杆菌JM109感受态中,挑取转化子培养提取质粒,将得到的重组质粒pPIC9K-CAD转入毕赤酵母GS115中,挑取阳性克隆,得到两株抑菌效果较好的基因工程菌株GS115/pPIC9K-CAD-5和GS115/pPIC9K-CAD-9,甘油保存菌株。2.利用引物扩增出带有EcoR I和Not I位点的天蚕素AD基因,将其与同样双酶切的载体pGAPZαA连接,连接产物转入大肠杆菌感受态细胞,得到质粒pGAPZαA-CAD经线性化后电击转入毕赤酵母X33电击感受态中,得到基因工程菌株X33/GCAD-3。将构建好的质粒pUCGAP-CAD电击转化至X33/GCAD-3的电击感受态中,最终得到多拷贝菌株X33/GUCAD-3,甘油保存菌株,以该菌株为后续实验菌株。3.利用Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白胶和LC-MS鉴定X33/GUCAD-3发酵产物,结果表明该抑菌物质为天蚕素AD。以YDFM、YPD和BMGY分别为发酵培养基,结果表明最适宜的发酵培养基为YDFM培养基。以甘油、葡萄糖和麦芽糖分别为唯一碳源,结果表明最适碳源为甘油。对氮源添加量及初始pH进行了条件优化,结果表明在其24 h和48 h分别补料5 g/L的有机氮源,且初始pH为7.0时,抑菌效果最好,其抗菌生物效价为8.84×10~8 U/L。4.确定了天蚕素AD的抗菌谱,表明其抗菌谱较广,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌活性,但对真菌无抑菌活性。天蚕素AD对部分常见致病菌均有抑菌活性。耐高温性较强,在100℃下放置3 h仍能具有较高抑菌活性。与未用蛋白酶处理的天蚕素AD相比,分别用30 U/mL的胃蛋白酶和蛋白酶K处理天蚕素AD 2.5 h时,其抑菌活性表现出一定程度的下降,且天蚕素AD在30 U/mL的胰蛋白酶下仍能具有一定的抑菌活性,但相对于未用胰蛋白酶处理的天蚕素AD,其抗菌活性出现较大程度的下降。通过溶血活性实验检测表明天蚕素AD不具有溶血活性。