近年来抗生素的滥用导致了生物体内菌群失调和多种耐药性菌株的产生等后果，从而引发公共卫生和食品安全等问题，因此我们急需寻找到一种新型抗菌药物来缓解这些问题。抗菌肽是生物抵御外来病菌时，在体内迅速合成的具有免疫抗菌活性的肽类物质。抗菌肽还具有结构和活性稳定、不易产生耐药性、体内无药物残留、对环境污染小等优点，进而受到越来越广泛的关注。鱼类生活在含有多种微生物的水域环境中，会与大量病原体频繁接触，具备非常发达的非特异性免疫系统。抗菌肽是鱼类非特异性免疫系统的重要组成部分，能够在鱼类受到损伤或病原体入侵时迅速产生并在体内扩散。本文主要研究两种鱼类抗菌肽，一种是斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）来源的hepcidin，另一种是大西洋庸鲽（Hippoglossus hippoglossus L.）来源的组蛋白H2A的N端衍生物hipposin。　　Hepcidin是由生物肝脏细胞表达的一类具有抗菌作用和铁代谢调节功能的碱性小分子肽，在机体免疫系统中发挥了重要作用。Hepcidin在各物种间具有较高的结构保守性，由信号肽、前导肽和成熟肽这三部分构成，尤其是在成熟肽区域含有8个半胱氨酸残基，以致在空间上可形成4个二硫键，这与其结构稳定和生物活性有着密切关系。Hepcidin最初从人血清中分离得到，之后在多种鱼类中都有发现，但对于鱼类hepcidin的重组表达研究还鲜有报道。　　Hipposin是大西洋庸鲽组蛋白H2A的N端衍生物，由Birkemo等从大西洋庸鲽的皮肤黏液中分离得到。Hipposin在结构上由α螺旋和无规则卷曲构成。它含有51个氨基酸，其中15个碱性氨基酸，无酸性氨基酸。迄今为止，关于hipposin的研究为数不多，更从未有人将其进行过重组表达。　　本实验主要开展了对鱼类来源的抗菌肽hepcidin和hipposin在毕赤酵母中的表达、分离纯化和活性检测等研究，包括以下五个部分：　　第一部分为基于SOE-PCR的两种鱼类hepcidin成熟肽的cDNA串联及重组表达载体的构建。根据已有的斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽的cDNA（mCH）及尼罗罗非鱼hepcidin成熟肽的cDNA（mTH）作为模板，设计含有交叉互补序列的引物，通过SOE-PCR将mCH和mTH基因进行串联。再以串联片段mCH-mTH为模板，设计出含EcoR I和Not I酶切位点的引物以扩增出粘性末端。通过T4DNA连接酶将经双酶切处理过的mCH-mTH和表达载体pPIC9K进行连接，以构建重组表达载体pPIC9K-mCH-mTH。经菌落PCR检测、双酶切鉴定及测序表明重组表达载体pPIC9K-mCH-mTH已成功构建。　　第二部分为mCH-mTH在毕赤酵母GS115中的表达及纯化。将构建好的pPIC9K-mCH-mTH重组质粒用Sac I线性化后，电转化到毕赤酵母菌GS115中。经过不含His的MD平板，含不同浓度的G418的YPD平板以及MD、MM平板筛选，获得His+Mut+高拷贝转化子，提取其酵母基因组验证目的基因是否整合入酵母染色体中。筛选好的菌株在BMGY培养基中培养，随后转接至BMMY培养基中，在30℃摇床培养，通过1％甲醇诱导表达，发现在72小时表达量达到最高。取72小时的发酵上清通过SP-Sepharose阳离子交换层析对目的蛋白进行分离纯化。通过Folin酚法测得mCH-mTH的表达量为77mg/L。　　第三部分为mCH-mTH的抑菌活性鉴定。发酵上清浓缩10倍后，采用琼脂糖弥散法进行抑菌活性检测，发现其对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的铜绿假单胞菌具备良好的抑制效果，可以看到明显的抑菌圈。纯化后的目的蛋白 mCH-mTH通过微量肉汤稀释法，发现其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌均有较强的抑菌效果。　　第四部分为hipposin基因的合成及其重组表达载体的构建。根据毕赤酵母密码子的偏爱性对 hipposin基因（HIP）进行密码子优化，并且在5’端添加信号肽酶Kex2识别位点编码序列，3’端添加6×His标签的编码序列，两端分别添加XhoI和Xba I酶切位点，经密码子优化后进行人工合成。合成后的HIP与表达载体pPICZαA构建真核重组表达载体pPICZαA-HIP，通过双酶切检测重组表达载体是否构建成功，基因测序进一步验证。构建好的重组表达载体经Sac I线性化后，电转化至毕赤酵母X-33，通过Zeocin抗性筛选出高拷贝克隆子，并提取其酵母基因组验证目的基因HIP已成功整合至酵母染色体中。　　第五部分为hipposin在毕赤酵母X-33中的表达及纯化。筛选好的菌株在BMGY中培养，随后转接至BMMY培养基中，在30℃摇床培养，通过1%甲醇诱导表达96小时表达量达到最高。进一步进行Western Blot分析，结果显示目的蛋白hipposin已诱导表达。收集96小时发酵上清，利用蛋白质纯化系统，通过固化金属离子亲和层析（IMAC）对目的蛋白进行分离纯化。