研究背景胰腺星状细胞（Pancreatic stellate cell,PaSC）是胰腺区域中发现的具有外分泌功能的多样细胞,PaSC激活后可转化为肌成纤维样细胞,多项研究提示活化的PaSC是病理条件下细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）蛋白的主要来源,促进胰腺纤维化。作为慢性胰腺炎重要的组织病理学特征,胰腺纤维化也是引起胰腺功能障碍的重要原因,并且和胰腺癌的发生和进展密切相关。现有研究表明胰腺纤维化的中心环节即为PaSC的激活,参与PaSC活化的因素很多,在胰腺损伤、炎症或毒性物质刺激下,腺泡细胞、巨噬细胞及血小板被激活,分泌TGF-β、TNF-α、IL-6、PDGF等因子,同时活化的PaSC以自分泌的方式释放上述因子,进一步促进PaSC活化,形成恶性循环,进一步加快纤维化的进程。大量研究探寻纤维化相关的通路和信号因子,通过这些分子和通路试图对PaSC的活化进行抑制或者逆转,以达到对纤维化进程的延缓。溴结构域超末端（Bromodomain extral terminus,BET）蛋白属于溴结构域（Bromodomain,BRD）蛋白家族,BRD2,BRD3,BRD4和 BRDT 都属于 BET 蛋白家族,其参与识别组蛋白赖氨酸乙酰化,在表观遗传调控中起到关键作用。研究表明通过下调基因c-Myc,BRD4能可以抑制肿瘤的发生和发展。Kumar等研究发现BET蛋白抑制剂JQ1可通过抑制胰腺星状细胞内BRD4,减少I型胶原的产生,同时减少胰腺癌小鼠胰腺纤维化程度及胶原的沉积,但其具体作用机制尚不明确。因此,本课题将深入探讨BET蛋白抑制剂对PaSC的影响及作用机制,为逆转胰腺纤维化寻找新方向。研究表明,在哺乳动物中,Hippo通路能够对细胞生长,细胞分化和细胞凋亡信号进行整合,并以此调控器官的发育。转录调控因子Yes相关蛋白1（Yes-associatedprotein 1,YAP）是该通路的核心。一系列激酶的激活过程都有Hippo通路的参与,而且其会在胞浆中磷酸化降解YAP,非磷酸化的YAP通过进入细胞核可激活一系列的转录因子,如TEADs、SMAD、RUNX和CTGF。近期研究显示来自于胰腺癌的胰腺组织中存在明显的YAP上调,并且参与胰腺癌的发生、发展及复发过程,在其中发挥了重要作用,同时YAP基因沉默可抑制胰腺癌细胞增殖,进而抑制旁分泌介导的PaSC的激活,减少癌旁ECM生成。此外,研究表明YAP参与调节肝星状细胞的活化,但其对PaSC的直接作用尚无人报道。因此,本课题将深入探讨YAP对PaSC的影响及作用机制,为减少胰腺癌癌旁ECM形成及逆转胰腺纤维化寻找新靶点。第一部分 BET蛋白抑制剂对胰腺星状细胞活化、增殖及合成细胞外基质的影响目的:观察BET蛋白抑制剂对PaSC活化、增殖及合成细胞外基质（extracellular matrix,ECM）等生物学特性的影响,同时检测其对慢性胰腺炎小鼠胰腺纤维化的作用。方法:（1）Western blot法检测不同浓度BET蛋白抑制剂iBET151对鼠源性永生系PaSC（Immortalized pancreatic stellate cells,imPaSC）及人 PaSC（Human pancreatic stellate cells）的星状细胞标记物α-SMA、细胞外基质collagenI,fibronectin（FN）、钙黏附蛋白11（Cadherin-11,CDH11）及 MAPK/ERK 信号通路的影响。（2）MTT 法检测 iBET151 对活化imPaSC的增殖影响。（3）qPCR法检测iBET151对imPaSC活化及ECM合成相关RNA 水平的影响。（4）Western blot 检测iBET151 对转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）刺激后星状细胞标记物α-SMA、细胞外基质collagenI,fibronectin、钙黏附蛋白11（Cadherin-11,CDH11）、血小板衍生生长因子受体β（Platelet-derivedgrowth factorreceptor-β,PDGFR-β）及MAPK/ERK信号通路的影响。（5）实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,qPCR）检测 iBET151 对 TGF-β 干预后 PaSC 活化及ECM合成的作用。（6）采用24只8周龄雄性C57BL/6小鼠作为实验对象,对照组（n=6）注射等量 DMSO/（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin,JQ1 组（n=6）腹腔注射 JQ1（1inj/天,5天/周,50mg/kg）,雨蛙素组（n=6）采用反复腹腔注射雨蛙素（7inj/天,2天/周,4 周,50μg/kg）+DMSO/（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin,雨蛙素+JQ1（50mg/kg）造模组（n=6）,造模期间每周测小鼠体重。均采用HE染色及Trichrome染色评估造模是否成功;采用免疫荧光法检测CP小鼠胰腺外分泌部胰腺星状细胞PaSC的增殖（Ki67）及活化（α-SMA）情况,Trichrome染色评估胶原沉积范围;采用Western blot检测胰腺纤维化相关蛋白表达情况。结果:（1）Westernblot结果显示,不同浓度iBET151（0-2μM）及不同时间点（6h,24h,48h）刺激PaSC,iBET151可呈浓度依赖性地抑制imPaSC及hPaSC的α-SMA、collagen Ia1,FN、CDH11、p-ERK及PDGFR-β的表达。（2）MTT结果显示,与对照组相比,iBET151组的PaSC增殖能力明显降低（p<0.05）。（3）qPCR结果显示,iBET151组α-SMA及collagen Ia1基因表达明显降低,增加PaSC静止状态标志物胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）的基因表达（p<0.05）,同时可明显减少白介素-6（Interleukin 6,IL-6）、人单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1）、成纤维激活蛋白（Fibroblast activation protein,FAP）、肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）炎症因子及细胞因子的基因表达（p<0.05）。（4）Westerm blot结果显示5ng/ml TGF-β 可明显增加 PaSC 的 α-SMA、fibronectin、CDHl1 蛋白表达（p<0.05）,1μMiBET151可显著抑制TGF-β对PaSC的作用。（5）q-PCR结果显示,5ng/ml TGF-β可明显升高PaSC 的 α-SMA、FN、CDH11、IL-6 及 MCP-1 基因表达,1μM iBET151 可显著抑制 α-SMA、FN、CDH11、IL-6及MCP-1基因的升高。（6）小鼠体重增加由高到低依次为空白对照组,JQ1组,CP组,JQ1+CP组,JQ1腹腔注射明显抑制了小鼠体重的增加,空白对照组及JQ1组胰腺组织未见异常,CP组及JQ1+CP组胰腺组织切片H&E染色结果显示模型组存在腺泡萎缩,导管周围及腺泡间出现不同程度的纤维化,部分腺泡被导管样结构所代替,大量的炎症细胞浸润。Trichrome染色可见CP组及JQ1+CP组存在大量胶原沉积,定量结果显示两组间未见明显差异（p>0.05）。免疫荧光染色结果显示,CP组及JQ1+CP组小鼠胰腺内均存在较多α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的PaSC细胞,JQ1+CP未见明显减少。Western blot结果显示CP组及JQ1+CP组小鼠胰腺α-SMA、FN、Colla1、CDH11、PDGFR-β蛋白水平明显升高,CP组与JQ1+CP组未见明显差异。结论:BET蛋白抑制剂可抑制PaSC的增殖和合成ECM蛋白的能力,且减少PaSC分泌促炎因子、炎症因子及促细胞生长因子。同时,BET蛋白抑制剂可抑制TGF-β对PaSC活化的促进作用。第二部分 BRD2及BRD4蛋白在胰腺星状细胞活化、增殖及合成细胞外基质的作用目的:在第一部分中,我们已观察到BET蛋白抑制剂能够抑制PaSC活化、增殖及ECM的合成,为了进一步阐明BRD蛋白家族在PaSC增殖和促纤维化反应中的作用,我们利用RNA干扰技术,分别干扰BRD2及BRD4后,观察其对PaSC增殖及合成ECM相关蛋白的影响。方法:（1）利用Dharmacon公司合成的siRNABRD2及siRNABRD4进行BRD2和BRD4的干扰实验,具体步骤根据RNAi产品手册进行操作。利用qPCR、Western blot检测RNAi效果。（2）分别转染BRD2及BRD4后,Westernblot法检测活化的PaSC表达 α-SMA、collagen Ia1,FN、CDH11、p-ERK、PDGFR-β 蛋白水平的变化。（3）分别转染BRD2及BRD4后,MTT法检测PaSC的增殖情况。（4）分别转染BRD2及BRD4后,qPCR检测活化的 PaSC 表达 α-SMA、collagen Ia1,FN、CDH11、MCP-1、IL-6、HGF基因水平。（5）分别转染BRD2及BRD4后,免疫荧光法检测活化的PaSC中SMA及FN的表达。（6）转染BRD2及BRD4后,Western blot检测TGF-β刺激后星状细胞标记物α-SMA、collagenI,FN、CDH11及MAPK/ERK信号通路的影响,同时q-PCR检测TGF-β干预后PaSC活化及ECM合成的作用。结果:（1）利用qPCR检测RNAi效果,结果表明,与mock组相比,干扰BRD448小时后,基因沉默效果最高,达85%,干扰BRD2 32小时后,基因沉默效果最高,达60%。同时蛋白质水平检测BRD2基因沉默效果,干扰24h后,BRD2的表达水平降低70%,可持续至48h。（2）Western blot结果显示,转染BRD2 48h后,与对照组相比,α-SMA,CDH11及PDGFR-β蛋白表达减少,FN,collagen Ia1及p-ERK未见降低;转染BRD4 48h后,与对照组相比,FN、collagen Ia1、CDH11及PDGFR-β蛋白水平降低,α-SMA及p-ERK蛋白表达未见减少。（3）MTT检测结果显示,转染BRD2 48h后,与对照组相比,PaSC增殖未见明显变化;转染BRD4 48h后,与对照组相比,PaSC增殖明显减少。（4）mRNA水平显示,转染BRD2 32h后,与对照组相比,α-SMA,CDH11及 IL-6 基因表达减少,FN,collagen Ia1、MCP-1、HGF、FAP 未见降低;转染 BRD448h后,与对照组相比,FN、collagenIa1、CDH11、HGF基因水平显著降低,α-SMA、FAP、MCP-1、IL-6基因表达未见减少。（5）IF结果显示,转染BRD2 48h后,α-SMA表达减少,FN未见减少;转染BRD4 48h后,FN表达降低,α-SMA表达未减少。结论:BRD2参与调节胰腺星状细胞标志物α-SMA的表达,BRD4蛋白参与胰腺星状细胞的增殖及细胞外基质的产生,与胰腺纤维化密切相关。第三部分 BET蛋白抑制剂对胰腺星状细胞YAP表达的调节作用及机制目的:观察BET蛋白抑制剂对胰腺星状细胞YAP表达的调节作用,同时我们利用RNA干扰技术,分别干扰BRD2及BRD4后,观察其对YAP的影响。方法:（1）Western blot法检测不同浓度BET蛋白抑制剂iBET151对鼠源性永生系PaSC及人PaSC的YAP蛋白表达的作用。（2）qPCR检测iBET151对活化imPaSC中YAP基因表达的影响。（3）分别转染BRD2及BRD4后,Western blot法检测活化的PaSC表达YAP蛋白水平的变化。（4）分别转染BRD2及BRD4后,qPCR检测活化的PaSC表达YAP基因水平。结果:（1）Western blot结果显示,不同浓度iBET151（0-2μM）及不同时间点（6h,24h,48h）刺激PaSC,iBET151可呈浓度依赖性地抑制imPaSC及hPaSC的YAP蛋白的表达。（2）qPCR结果显示,iBET151组YAP基因表达明显降低（p<0.05）。（3）Western blot结果显示,转染BRD4 48h后,与对照组相比,YAP及p-YAP蛋白表达减少;转染BRD2 48h后,YAP及p-YAP蛋白表达未见显著变化。（3）mRNA水平显示,转染BRD432h后,与对照组相比,YAP基因表达减少;转染BRD2 48h后,与对照组相比,YAP基因水平无显著变化。结论:BET蛋白抑制剂可抑制PaSC中YAP蛋白及基因表达,且BRD蛋白家族中BRD4参与调控YAP的表达。第四部分YAP在胰腺星状细胞活化、增殖及合成细胞外基质中的作用目的:观察YAP在慢性胰腺炎及胰腺癌组织中的表达,检测不同活化程度PaSC中YAP表达水平,同时为了进一步阐明YAP在PaSC增殖和促纤维化反应中的作用,我们利用RNA干扰技术,干扰YAP后,观察其对PaSC活化程度、增殖及合成ECM相关蛋白的影响。方法:（1）采用8周龄雄性C57BL/6小鼠作为实验对象,分为对照组,复发性急性胰腺炎（Recurrent acute pancreatitis,RAP）组:常规雨蛙素剂量（50ug/kg）刺激7inj*2天（间隔1天）,CP组:反复雨蛙素（50ug/kg）刺激7inj*2天/周,共四周,其中RAP组分为d1（RAP第一天,1次AP）,d3（RAP第三天,2次AP）,d5（RAP第五天,2次AP）三组。取各组小鼠的胰腺组织制成4μm的石蜡切片,行免疫荧光双标染色（α-SMA/YAP）,同时Western blot 比较各组胰腺表达YAP、CDH11、ERK及PDGFR-β的蛋白水平。（2）采用Ptfl-Cre;LSL-KrasG12D/+（KC）基因突变小鼠及野生型小鼠作为实验对象,正常饲养三月后取小鼠胰腺组织,采用Western blot检测YAP、CDH11、CK19及PDGFR-β的蛋白水平。（3）新鲜分离人及小鼠的胰腺组织用于原代PaSC细胞的分离,对传代培养的PaSC行q-PCR,检测不同活化程度PaSC中YAP基因表达水平,同时行免疫荧光双标染色（α-SMA/YAP）。（4）利用ThermoFisher Scientific公司合成的siRNA YAP进行YAP的干扰实验,具体步骤根据RNAi产品手册进行操作,利用qPCR检测RNAi效果。转染YAP后,MTT法检测PaSC的增殖情况,同时qPCR检测与PaSC活化及ECM合成相关的基因水平变化。结果:（1）Western blot结果显示,与正常组比较,RAP d3,RAP d5及CP组小鼠YAP、CDH11、ERK及PDGFR-β蛋白表达明显升高。同时免疫荧光结果显示RAP d5组小鼠PaSC活化指标α-SMA及YAP表达明显强于正常小鼠。（2）与野生型小鼠相比,KC基因突变型胰腺癌小鼠的胰腺表达YAP、CDH11、CK19及PDGFR-β蛋白明显升高。（3）q-PCR结果显示,imPaSC及hPaSC由静止转化为活化状态后,YAP基因表达与α-SMA基因表达同步升高。IF结果显示来源于正常人的hPaSC、胰腺癌患者的hPaSC及KC胰腺癌小鼠的mPaSC均表达YAP,且大量位于细胞核中。（4）利用qPCR检测RNAi效果,结果表明,与mock组相比,干扰YAP24h后,基因沉默效果最高,达80%以上,48h沉默效果约60%。MTT检测结果显示,转染YAP 24h后,与对照组相比,PaSC增殖明显减少（P<0.05）。q-PCR结果显示,PaSC转染YAP48h后,参与胶原蛋白和其他ECM蛋白降解的金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3,MMP3）水平显著增加,PaSC活化指标α-SMA,细胞外基质合成相关的COL1A1、FN,刺激PaSC炎症纤维化反应TGF-β基因水平降低,同时参与细胞黏附及ECM重构的结缔组织生长因子（Connectivetissuegrowthfactor,CTGF）、富含半胱氨酸的血管生成诱导剂 61（Cysteine rich angiogenic inducer 61,Cyr61）RNA 水平被显著抑制。结论:YAP表达高低与PaSC活化、增殖相关,PaSC活化及胰腺纤维化程度越高,YAP表达越多,敲除YAP基因可抑制PaSC活化、增殖及细胞外基质的合成。