【摘 要】
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目的:机械应力通过激活新型机械敏感离子通道受体Piezo1介导软骨细胞凋亡参与骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的发病过程,但是负性调节机械应力信号传导的相关机制尚未阐明。本研究目的是探究雌激素相关信号转导通路在机械应力所致骨关节炎软骨细胞凋亡中的作用,明晰机械应力相关雌激素受体的类型。并进一步研究G蛋白偶联雌激素受体（G protein coupled estrogen recept
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目的:机械应力通过激活新型机械敏感离子通道受体Piezo1介导软骨细胞凋亡参与骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的发病过程,但是负性调节机械应力信号传导的相关机制尚未阐明。本研究目的是探究雌激素相关信号转导通路在机械应力所致骨关节炎软骨细胞凋亡中的作用,明晰机械应力相关雌激素受体的类型。并进一步研究G蛋白偶联雌激素受体（G protein coupled estrogen receptors,GPER）在机械应力介导的骨关节炎软骨细胞凋亡中的机制,以及Yes相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）的亚细胞定位及表达,ARHGAP29/Rho A/LIMK/Cofilin通路,肌动蛋白的动力学及Piezo1在此过程中的作用。方法:分离培养人OA软骨细胞,以慢病毒为载体转染Piezo1-siRNA,基因芯片技术检测沉默Piezo1后基因表达谱的变化,IPA分析芯片数据,确定雌激素相关通路为显著变化通路及GPER为目标基因,实时聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）和Western blot分别从m RNA和蛋白水平对芯片结果进行验证;取临床人OA及对照软骨组织标本,免疫组织化学染色GPER,RT-PCR和Western blot检测其在软骨组织中的表达,统计分析GPER的表达与OA的相关性;建立体外力学刺激下的OA软骨细胞模型,综合运用雌激素、GPER的特异性激动剂G-1、GPER的特异性抑制剂G15、GPER-siRNA及YAP-siRNA处理软骨细胞,流式细胞术测定细胞存活率,激光共聚焦显微镜下观察聚合态肌动蛋白和Piezo1的表达,对YAP进行亚细胞定位,Western blot验证YAP/ARHGAP29/Rho A/LIMK/Cofilin通路表达的变化;建立大鼠骨关节炎模型,番红固绿染色膝关节标本,国际骨关节炎研究协会（OARSI）评分评估关节病变情况,免疫化学检测GPER和YAP的表达情况。结果:Piezo1-siRNA转染软骨细胞的表达谱显示,GPER表达显著上调且传统雌激素受体变化差异无统计学意义,RT-PCR和Western blot的结果与芯片结果相一致;与对照软骨相比,OA软骨组织中GPER表达减少,GPER与OA软骨退变呈负相关;雌激素处理可有效减轻机械应力所致的软骨细胞凋亡,此过程可被G-15或转染GPER-siRNA有效阻断,G-1处理可模拟雌激素的作用提高软骨细胞存活率,G-1激活GPER直接靶向YAP,促使机械应力所致的YAP胞浆定位转移至细胞核,促进ARHGAP29的表达,负调控机械应力介导的Rho A/LIMK/Cofilin的激活,以及肌动蛋白聚合,最终导致Piezo1抑制,YAP-siRNA转染后,肌动蛋白聚合和Piezo1激活明显增加,软骨细胞凋亡增多;骨关节炎大鼠模型成功建立,OARSI评分与关节病变程度呈正相关,G-1关节腔注射处理显著降低了OA组大鼠升高的OARSI评分,同时OA组大鼠关节软骨中GPER及YAP表达下降,G-1处理可有效增加OA组GPER及YAP的表达。结论:本研究证实GPER可有效减轻OA进展过程中机械应力介导的软骨细胞凋亡,这是通过YAP核定位及ARHGAP29/Rho A/LIMK/Cofilin途径,抑制肌动蛋白的聚合和Piezo1的激活实现的。本研究阐明了负性调节机械应力介导软骨细胞凋亡的一种新机制,并发现了GPER作为骨关节炎治疗的潜在治疗靶点。
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