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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是一种具有高度传染性的病原体,主要通过定殖于家禽的气管黏膜,导致家禽慢性呼吸道疾病(Chronic Respiratory Disease,CRD)。MG感染率极高,不同年龄、性别和品种的鸡均可常年感染,迄今仍未找到有效的防控措施,给世界家禽产业造成巨大的经济损失。寻求防控CRD的有效方法,必须深入阐明MG的致病机理。研究表明,micro RNAs(miRNAs)在多种疾病中异常表达,通过调控其靶基因在疾病的发生发展中发挥重要作用。本研究基于课题组前期高通量测序的结果,探讨gga-miR-142-3p及其靶基因TAB2在MG感染中的作用及分子机制,为阐明MG的致病机理及诊断提供理论依据。我们以不同感染时期的SPF鸡胚和鸡胚成纤维细胞(DF-1)为研究对象,运用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)测定了组织和细胞中gga-miR-142-3p以及TAB2的相对表达水平;应用双荧光素酶报告系统验证了TAB2是gga-miR-142-3p的靶基因;进一步通过gga-miR-142-3p的过表达和抑制试验确证了gga-miR-142-3p与TAB2的靶向调控关系。通过RT-q PCR及ELISA检测了gga-miR-142-3p和TAB2过表达以及敲低时,DF-1细胞中促炎因子白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平。同时,通过CCK-8试剂盒检测了DF-1细胞的增殖情况;通过流式细胞仪检测了细胞周期变化以及细胞凋亡情况。主要结果如下:1.动物和细胞试验表明,在MG感染的SPF鸡胚和DF-1细胞中,gga-miR-142-3p的表达量随攻毒时间而变化。与未感染组相比,MG感染的鸡胚肺组织中gga-miR-142-3p的表达量在感染后第6 d极显著下调(p<0.01),在感染后第9 d(p<0.01)和第12 d显著上调(p<0.05)。在MG感染的DF-1细胞中,gga-miR-142-3p的相对表达量11 h前逐渐下调,11h表达量最低(p<0.001),11h后表达量逐渐上升,26 h显著上调(p<0.05)。2.利用Targetscan和miRDB在线软件预测gga-miR-142-3p的靶基因,gga-miR-142-3p与TAB2 3’UTR(394-401bp)严格碱基互补配对,且靶序列的物种保守性高,结合功能分析我们初步选择TAB2是gga-miR-142-3p的靶基因。3.双荧光素酶报告系统分析显示:gga-miR-142-3p过表达极显著下调靶基因TAB2野生型3’UTR的荧光素酶活性(p<0.01),而对突变型的荧光素酶活性无影响,证实gga-miR-142-3p种子序列与TAB2 3’UTR结合,TAB2可能是gga-miR-142-3p的靶基因。4.gga-miR-142-3p过表达和敲低试验表明,gga-miR-142-3p可以负向调控TAB2的表达(p<0.05)。gga-miR-142-3p过表达可以显著下调TAB2 m RNA和蛋白质的表达水平(p<0.01),而gga-miR-142-3p敲低则会显著上调TAB2 m RNA和蛋白质的表达水平(p<0.01),证实TAB2是gga-miR-142-3p的直接靶基因,且gga-miR-142-3p负向调控TAB2的表达。5.在MG感染的SPF鸡胚和DF-1细胞中,TAB2的表达量随攻毒时间而变化且差异显著。在MG感染后第6 d的鸡胚肺组织中,TAB2的表达水平极显著高于正常组(p<0.01);然而,感染MG后第9天和第12天鸡胚肺组织中TAB2的表达水平明显低于正常组(p<0.01)。在MG感染的DF-1细胞中TAB2的表达量在前15 h极显著高于对照组(p<0.05),TAB2的表达量在第26 h显著低于对照组(p<0.05)。结果表明,gga-miR-142-3p的表达量与TAB2的表达量呈明显负相关。6.gga-miR-142-3p和TAB2的功能研究表明,gga-miR-142-3p可以通过靶向TAB2抑制MG感染引起的促炎因子表达,TAB2是gga-miR-142-3p的功能性靶标。超表达gga-miR-142-3p或者敲低TAB2可以显著抑制MG感染引起的DF-1细胞中促炎因子表达量的上调(p<0.05);抑制gga-miR-142-3p或超表达TAB2可以显著促进MG感染引起的促炎因子的表达量上调(p<0.05)。设置机制挽救实验,证实同时过表达gga-miR-142-3p以及TAB2可以抵消gga-miR-142-3p过表达引起的促炎因子表达量的下调;而gga-miR-142-3p以及TAB2双敲低挽救了gga-miR-142-3p抑制物造成的促炎因子表达量上调。7.分子机制研究表明:超表达gga-miR-142-3p或者敲低TAB2可以显著抑制MG感染引起的DF-1细胞中NF-κB和MAPK信号通路的激活(p<0.05),表明gga-miR-142-3p可以通过靶向TAB2抑制NF-κB和MAPK信号通路的活性,从而抑制MG感染引起的炎症反应。8.细胞增殖、细胞周期和凋亡实验表明,MG感染可明显抑制DF-1细胞增殖,阻断细胞周期过程,促进细胞凋亡。超表达gga-miR-142-3p可以显著促进MG感染的DF-1细胞在24 h、48 h和72 h的增殖,促进细胞周期向G2+S期迁移,抑制细胞凋亡;而抑制gga-miR-142-3p会显著抑制感染细胞的增殖,上调G1期细胞的比例,促进细胞凋亡。同时,gga-miR-142-3p和TAB2双敲低挽救了gga-miR-142-3p抑制造成的上述细胞表型。该研究表明鸡感染MG后上调的gga-miR-142-3p抑制了靶基因TAB2的表达,抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活,减少炎症反应,促进细胞增殖,并抑制细胞凋亡以抵抗MG感染。