第一部分当归六黄汤抗肝纤维化机制的网络药理学研究及实验验证背景肝纤维化是多种慢性肝病共有的病理变化过程,其本质是多种致病因素引起的细胞外基质大量沉积和胶原纤维增生。若不及时治疗,可导致终末期肝病、肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。然而,目前除了肝移植外,许多疗法仍处于临床前研究阶段,缺少行之有效的可以彻底治愈该疾病的方法。因此,我们急需寻找有效的抗肝纤维化治疗方法。传统中药是补充和替代医学体系的重要组成部分,在中国用于临床治疗疾病已有多年的历史。当归六黄汤(DGLHD)是由当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏、黄芪组成的一种经典中药复方,在临床上可用于治疗糖尿病、感染、心肌炎等。大量研究表明DGLHD的组成成分如黄芪、当归、黄连具有抗炎、抗纤维化和保肝作用。然而,DGLHD是否具有抗肝纤维作用、潜在的作用机制是什么,发挥药效的活性成分和作用靶点有哪些,仍不清楚。目的采用网络药理学的方法探究DGLHD所含的活性成分及其抗肝纤维化的作用靶点,然后采用动物和细胞实验验证预测结果,以阐明DGLHD抗肝纤维化的作用机制,为肝纤维化的治疗提供新方法。方法1)DGLHD活性成分和靶点的预测从TCMSP、TCM Database@Taiwan、PubMed等数据库及相关文献资料中收集DGLHD及其所含七味单药的化学成分和靶点,并分析各味单药所含成分的物理化学性质异同点。挑选OB≥30%和/或DL≥0.1的化合物作为潜在活性成分,其对应的靶点作为发挥药效的潜在靶基因或蛋白。2)网络分析从OMIM、Genecards、KEGG等数据库中收集肝纤维化疾病相关的靶点。然后对DGLHD中度值大于3的作用靶点进行GO功能和通路富集分析,探究DGLHD与肝纤维化之间的关系,并使用Cytoscape 2.8.3软件对DGLHD的活性成分、作用靶点及肝纤维化有关靶点进行网络可视化分析。3)实验验证C57BL/6J小鼠随机分为3组:空白组、模型组、DGLHD(5.0g/kg)组,腹腔注射4%(v/v)的四氯化碳油溶液诱导小鼠肝纤维化模型,同时给予DGLHD治疗。6周后测定各组小鼠肝重指数及ALT、AST的活性,HE和Masson染色观察肝脏病理形态学变化,CBA和qRT-PCR检测小鼠血清和肝脏中TNF-α、IL-1β、TGF-β1和IFN-γ的表达,Western blot和qRT-PCR方法检测肝脏和活化HSC-T6细胞中TGF-β1、α-SMA、PPAR-γ、NF-κB的蛋白和基因表达水平,MTT法检测HSC-T6细胞增殖。结果中药复方DGLHD含有545个化学成分,其中75个化合物满足OB≥30%和/或DL≥0.1,并将其作为DGLHD的潜在活性成分。我们收集了75个活性化合物对应的286个活性靶点,其中有71个靶点的度值大于3。作用靶点的功能富集分析数据显示这些靶基因不仅可以调节细胞的生长、增殖、凋亡和信号转导,还可以影响炎症反应及PPAR和NF-κB的活性。通路富集分析结果表明DGLHD的活性靶基因主要富集于MAPK、NF-κB、PI3K/Akt、NAFLD和肝炎相关通路。DGLHD活性成分对应的71个靶点,其中有51个是肝纤维化的直接靶点,如PTGS2、NF-κBp65、PPAR-γ、PI3K、AKT1、TGF-β1。而且,DGLHD中的多种化学成分均可调节上述靶点的活性,如小檗碱、黄芩素、阿魏酸、黄连碱、黄芩苷、梓醇。因此,DGLHD中的某些化学成分可能通过这些靶点对肝纤维化进行干预治疗。实验验证结果表明DGLHD可明显减轻肝纤维化小鼠肝脏损伤和纤维化程度,降低ALT和AST的活性,减少细胞外基质合成和沉积,减弱炎性细胞因子表达,降低NF-κBp65和TGF-β1的活性,增强PPAR-γ基因和蛋白表达水平,发挥明显的肝保护和抗肝纤维化作用。结论DGLHD通过多成分、多靶点、多途径减弱炎症信号、抑制HSC细胞活化及细胞外基质聚集,阻止小鼠肝纤维化的发生与发展。第二部分当归六黄汤对肥胖相关胰岛素抵抗和脂肪肝的作用及机制研究背景肥胖是一种与多种疾病发生发展相关的病理状态,并常常伴随着炎症细胞浸润、糖脂代谢异常、胰岛素敏感性降低。研究表明受损的胰岛素信号转导与炎症反应、异常的糖脂代谢协同促进肝脏脂质生物合成和脂肪变性,从而导致胰岛素抵抗和脂肪肝的发生发展。而且,炎症、代谢异常、胰岛素抵抗和脂肪肝是肥胖个体中常见的相互影响的病理状态。多种免疫细胞均参与了肥胖相关炎症和代谢性疾病的发展,如DCs、Tregs、CD8+T细胞、B细胞。肥胖小鼠脂肪组织中Tregs数量的增加可以改善其胰岛素敏感性和脂肪聚集程度。清除CD11c-DTR转基因小鼠体内的DCs可改善肥胖相关炎症、胰岛素抵抗及肝脏脂肪变性,并减少脂质合成代谢相关基因的表达。由此可知,Tregs和DCs在炎症、胰岛素抵抗和脂肪肝的发展中起到了关键作用。随着现代生活方式的改变,肥胖相关疾病的发生率和死亡率逐年升高。然而,目前的治疗药物由于作用靶点单一、失效率高、副作用大等特点,并不能有效的阻止胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性的发展。现代药理学研究显示当归六黄汤具有降血糖、胰岛素增敏、抗炎、抗感染等作用。但DGLHD是否可以有效地抑制肥胖相关胰岛素抵抗和脂肪肝的发生发展及发挥这些药效的机制尚未阐明。目的采用瘦素基因缺陷的ob/ob小鼠模型,研究DGLHD抗胰岛素抵抗和脂肪肝的过程中免疫细胞、代谢产物和糖脂代谢的变化及机制,为DGLHD的临床应用提供依据,为中医药的研究开发提供新思路。方法Ob/ob小鼠随机分为4组:模型对照组、DGLHD(1.5g/kg)组、DGLHD(3.0g/kg)组、DGLHD(6.0g/kg)组,每组小鼠给予等体积的三蒸水或DGLHD。8周后测定各组小鼠肝重指数、内脏脂肪指数,OGTT和ITT实验分别测定小鼠的葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性,HE和油红O染色观察脂肪组织或肝脏病理形态学变化,免疫组化检测胰腺胰岛分泌胰岛素的水平,微板法检测血清及肝脏中TC、TG、FFA的含量,ELISA方法测定小鼠血清细胞因子、胰岛素及脂联素的含量,葡萄糖氧化酶法检测细胞消耗的葡萄糖量,流式细胞术检测免疫细胞的比例、表面标记及功能,MTT法检测混合淋巴细胞反应及细胞增殖水平,靶向代谢组学检测肝脏及脂肪组织中代谢产物的含量,Western blot和q RT-PCR法检测有关蛋白及基因的表达水平。体外实验研究DGLHD对DCs、T细胞和胰岛素抵抗3T3-L1细胞的作用,按照上述有关方法检测细胞因子、表面标记、葡萄糖消耗、蛋白及基因等指标。结果与模型组小鼠相比,给予ob/ob小鼠DGLHD后,小鼠肝脏组织的脂肪聚集变性减弱,血清和肝脏中FFA、TC、TG表达水平降低,肝脏和内脏脂肪组织的重量减轻,肝脏和内脏脂肪组织的形态结构较为规则完整,且剂量为6.0g/kg时的效果最为明显。此外,DGLHD可明显改善ob/ob小鼠的口服葡萄糖耐受性及腹腔胰岛素耐性,减少胰岛素分泌,并增加脂联素的表达水平。DGLHD还可明显降低小鼠血清、脾脏、肝脏及内脏脂肪组织中促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ的表达水平,并减弱T淋巴细胞的增殖。我们通过实验进一步发现DGLHD主要通过影响氨基酸和嘌呤代谢减少ob/ob小鼠脂肪和肝脏组织中异亮氨酸、腺苷和胆固醇含量,增加谷氨酰胺的表达水平。DGLHD促进ob/ob小鼠脾脏、淋巴结、肝脏及脂肪组织中Tregs分化及Foxp3基因表达,升高T细胞表面负性调节分子PD-1的水平。清除ob/ob小鼠体内的Tregs后,小鼠胰岛素抵抗、脂肪肝和炎症状态加重。有趣的是,给予DGLHD可逆转Tregs清除后的相关改变。体外实验显示DGLHD可抑制T细胞增殖,促进T细胞分化为Tregs,并促进Th1型细胞因子向Th2型细胞因子的转化。DGLHD降低DCs表面MHC-II和CD86的表达水平,增强负性共刺激分子PD-L1的表达,减弱DCs刺激T细胞增殖的能力,上调IDO和ILT-3的基因水平,抑制DCs分泌IL-12p70细胞因子。此外,DGLHD还可抑制Tregs清除小鼠体内DCs的成熟。体外实验结果也表明DGLHD抑制DCs成熟,减弱抗原呈递能力及IL-12p70的分泌。代谢相关指标表明DGLHD可减少DCs和T细胞的葡萄糖摄取,抑制PI3K/Akt通路的活化,增强PPAR-γ蛋白和基因的表达水平,促进体内和体外耐受性DCs和Tregs的形成。同时,DGLHD还可抑制肝脏和内脂肪组织中FAS、ACC-1、CD36、SREBP-1c基因的表达,激活PI3K/Akt信号通路,改善ob/ob小鼠肝脏和脂肪组织的糖脂代谢。在胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞中,DGLHD也可增加其葡萄糖消耗及脂联素水平,激活PI3K/Akt通路,减少脂质生物合成。结论DGLHD通过调节PI3K/Akt信号通路和PPAR-γ分子改善ob/ob小鼠的免疫和代谢稳态,发挥有效的抗炎、抗胰岛素抵抗和抗脂肪肝作用。