基于高分辨质谱技术的稳定同位素标记技术已经成为定量蛋白质组学研究中的核心方法之一。其中,基于二级质谱报告离子分析（MS2）的等重稳定同位素标记方法具有定量通量的优势,如商品化试剂盒TMT及iTRAQ等,目前在生命科学研究和临床诊断标志物发现等领域得到广泛应用。然而,针对微量蛋白鉴定和定量分析,等重标记蛋白定量方法仍未解决分析灵敏度的瓶颈,极大限制了蛋白质组的深度覆盖。本文设计并合成了两标等重稳定同位素磷酰化标记试剂（iSIPL 2-plex）,建立了高效的稳定同位素标记磷试剂的色谱分离制备方法,并通过核磁共振波谱仪、高分辨质谱等方法对相关结构进行表征和鉴定。该标记试剂基于特征磷酰胺报告离子的结构,具有质谱增敏效应。通过引入15N原子进行等重标记试剂的合成,标记肽段在二级质谱裂解过程中将产生高强度的m/z 180.0789和m/z 181.0758报告离子。该研究首先基于二乙氧基磷酰化丙甘二肽结构,合成不含稳定同位素的标记试剂（iSIPL0）,对标记试剂合成制备方法和蛋白标记条件进行系统优化,并与商品化标记试剂TMT0进行蛋白鉴定分析对比实验,发现在乙腈作为标记溶剂和20:1（标记试剂:肽段质量比）的条件下具有最优的蛋白鉴定结果,且证明过量标记试剂不会影响后续质谱分析,初步对比iSIPL0和TMT0标记HeLa细胞总蛋白酶解肽段结果,在标记1μg HeLa细胞蛋白酶解肽段时,iSIPL0检测到的蛋白数为1758个,TMT0检测到的蛋白数为1544个,说明iSIPL在低浓度蛋白的鉴定分析中具有一定优势,且鉴定结果与TMT具有互补性。iSIPL 2-plex定量结果表明,10 μg HeLa总蛋白酶解肽段样品标记后,共检测到1509个蛋白质,其中比率集中在0.75-1.25的蛋白质数量为1438个,占检测到总蛋白数的95.3%,说明iSIPL 2-plex在蛋白定量分析中具有准确性。随后,基于iSIPL2定量方法对HIV-1潜伏激活剂#6蛋白靶点进行定量鉴定分析,合成#6号药物的biotin连接探针分子,并进行分离制备和结构表征,发现9个潜在蛋白靶点。总之,基于有机磷化学的iSIPL蛋白定量分析为微量蛋白质定性与定量提供了一种新策略,为开发出高灵敏高通量新试剂奠定了基础。