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抗生素的发现与应用给人类及动物的健康带来了福音,促进了现代医学的发展。然而抗生素大量、广泛的使用也使细菌产生了耐药性,尤其是产MBLs(金属β-内酰酶)“超级耐药菌”的出现,严重地威胁畜禽养殖业的健康发展与公共卫生安全。碳青霉烯类抗生素是临床上治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的少数几类特效药物。目前,能高效水解碳青霉烯类抗生素的产MBLs(如NDM和VIM)耐药菌已在人医临床中广泛流行,且不断进化出药物水解活性更强的变异体,而被人医临床高度重视。值得注意的是,虽然碳青霉烯类药物未被批准用于我国畜禽养殖业,但产MBLs耐药菌株已在我国家禽养殖链条中出现和流行。然而,现有研究仅表明NDM和VIM是目前流行最广、最典型的MBLs,其在畜禽养殖业中的流行特点以及在畜禽养殖环境中的进化特征还未探明。本研究旨在探索我国畜禽源碳青霉烯类耐药菌中NDM和VIM的流行现状及其新型变异体耐药机制。本研究于2015-20]7年从我国山东和广东部分地区共采集畜禽及其相关养殖环境样品1160份,包括鸡源818份,猪源342份。菌株分离鉴定结果显示有433株菌为blaNDM阳性(鸡源426株,猪源7株)、4株菌为blaVIM阳性(均为鸡源)。其中,鸡源携带NDM的宿主菌为大肠杆菌(n=344,80.8%)和肺炎克雷伯菌(n=79,18.5%);猪源流行的NDM宿主菌为大肠杆菌(n=4,57.1%)和鲍曼不动杆菌(n=3,42.9%)。364株分型成功的blaNDM阳性菌中主要流行的 NDM 亚型为 NDM-5(n=207,55.8%),其次是 NDM-9(n=94,25.3%)和 NDM-1(n=63,17.0%)。4株blaVIM阳性菌中仅有一株为VIM-2。值得一提的是,有7株NDM(大肠杆菌)和3株VIM(恶臭假单胞菌)阳性菌株不能被归类到现有已知基因型,可能为新的MBLs变异体。对上述7株不含有已知NDM亚型的菌株序列分析,发现两种不同的NDM-1变异体,分别命名为NDM-17(6株)和NDM-20(1株),这是首次从畜禽源细菌中发现的新NDM变异体。与NDM-1相比,NDM-17和NDM-20的氨基酸序列同时存在V88L和M154L氨基酸替换(与NDM-5一致);同时还分别存在两个新的氨基酸替换位点(E170K和R270H)。与NDM-1和NDM-5相比较,NDM-17能介导更高水平的碳青霉烯类耐药;而NDM-20介导耐药能力与NDM-5 一致,但强于NDM-1。酶动力学试验表明NDM-17具有比NDM-1显著高的药物水解效率和比NDM-5高的药物亲和活性,表明NDM-17具有更好的酶活性。NDM-20水解青霉素类和头孢类药物的活性显著高于NDM-5,但碳青霉烯酶活性略低于NDM-5,这显示了 NDM-20可以特异性地提高酶的水解活性;也进一步提示了 NDM可能正在向提高酶活性或者提高特定类药物水解活性的方向进化。稳定性试验结果表明NDM-17和NDM-20的稳定性显著高于NDM-1,原因是M154L替换显著增加了 NDM的稳定性。基因定位结果显示blaNDM-17和blaNDM-20均定位于大小46,161bp的IncX3型可转移性质粒上。通过序列比对分析3株未能分型的VIM序列发现了一种VIM新变异体,将其命名为VIM-48。与VIM-2相比,VIM-48的C-末端存在11个连续氨基酸的改变,这种改变不同于VIM变异体以往单个氨基酸替换的进化方式。为了探明11个连续氨基酸对VIM-48的作用,本研究构建了 11个连续氨基酸的缺失株VIM-D(Δ)以及VIM-2为参照分析其生物活性。分析结果显示VIM-48比VIM-2和VIM-D(Δ)介导的碳青霉烯类耐药水平更高。酶动力学表明VIM-48通过增加亲和活性进而增强了碳青霉烯酶活性,而VIM-D(Δ)显著降低了酶催化效率,提示了 C-末端氨基酸对于维持VIM酶活性具有重要的作用。稳定性试验证实了 VIM-48的稳定性高于VIM-2;而缺失株VIM-D(Δ)显著降低了酶稳定性,说明C-末端11连续氨基酸的改变是VIM-48稳定性增强的成因。这些研究结果表明VIM-48可能是一种酶活性和稳定性增加的优势变异体,VIM的进化方式也存在从氨基酸的点替换向多位点连续替换扩大的迹象。综上所述,本研究在探索我国部分地区畜禽源碳青霉烯类耐药菌中NDM和VIM的流行现状研究的基础上,鉴定了 NDM-17、NDM-20和VIM-48三种MBLs新的变异体,阐明了它们生物活性特征,提示金属β-内酰胺酶可能正朝生物活性和稳定性增强的方向进化,这势必会加大碳青霉烯类耐药菌防控以及新药研发的难度。同时,研究揭示了 MBLs的进化不仅发生在医学临床耐药菌中,也发生于畜禽源耐药菌中;一旦这类菌株在畜禽中广泛流行,可存在着沿食物链传递的风险,将会给临床治疗带来更大的困难。对新型MBLs变异体的研究和认识还为碳青霉烯耐药菌的防控及公共卫生安全的风险评估奠定了理论基础和数据支持。