刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,T.gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,可感染全世界将近30%的人口。当免疫功能正常的人感染弓形虫后一般没有明显的症状,通常为隐性感染。但它可以由隐性感染状态转变成急性弓形虫病导致免疫功能受损的个体(如艾滋病患者)出现严重症状。另一个弓形虫的致命威胁是对胎儿的垂直传播,这可能导致自然流产、新生儿畸形等严重后果。由于没有合适的药物可以杀死包囊内的缓殖子,而磺胺嘧啶等西药也只能对急性感染后14天的虫体起作用,所以目前还没有办法控制这种疾病的传播。因此,先发制人的疫苗具有比现有的抗虫药物极为明显的优势。迄今为止,传统弓形虫疫苗的开发策略主要集中在亚单位疫苗和DNA疫苗上。但这两者都有一些问题,比如亚单位疫苗稳定性差并且可能引起不必要的免疫反应,而DNA疫苗具有整合到宿主细胞基因组中的理论风险。基于肽的疫苗可以克服这些弱点。他们使用最小的抗原表位来诱导所需的免疫反应,因此不太可能会引发过敏或自身免疫反应。因此,近年来基于肽的疫苗引起了越来越多人的关注。由于刚地弓形虫是一种生活史非常复杂的胞内寄生虫,因此合成含有多个不同表位的多抗原肽疫苗(Multiple antigenic peptide,MAP)可能是开发弓形虫疫苗一个有效的手段。理想的抵抗弓形虫的疫苗首先应该包括可以引发宿主Th1型免疫反应的抗原表位,该免疫反应的特征在于可以产生干扰素IFN-y,并对被感染的宿主细胞产生持久稳定的细胞毒性作用。小鼠CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CD8+cytotoxic T lymphocyte,CTL)介导的对脑内弓形虫包囊的抵抗作用,取决于其主要组织相容性复合体MHC Ⅰ类分子的Ld等位基因。弓形虫的分泌蛋白质如致密颗粒(Dense granules,GRAs)和棒状体蛋白(Rhoptry proteins,ROPs)是被小鼠 CD8+T淋巴细胞所识别的抗原蛋白,同时也是抗虫疫苗重要的候选抗原蛋白。来源于GRA6 的肽(HPGSVNEFDF)(HF10),和来源于 ROP7 的肽(IPAAAGRFF),是小鼠的保护性免疫显性Ld限制性表位。抗体在宿主对弓形虫的免疫中也起着重要作用,它们能直接阻断速殖子并损害其与宿主细胞的附着。SAG1是在速殖子的侵袭过程中最早与宿主细胞黏附的表面抗原蛋白,其免疫原性非常强,是B细胞表位最合适的抗原蛋白来源。SAG182-103是一个具有高度免疫原性的构象B细胞表位,但由于之前缺乏合适的载体来维持其原有的空间构象,因此一直以来未被视为疫苗候选分子。SAG1301-320是一个线性B细胞表位,可以保护小鼠免受弓形虫致命的攻击感染,而且能被弓形虫病患者的血清强烈识别出来。此外,CD4+T细胞也是感染弓形虫后机体免疫应答的重要组成部分。研究发现AS15是一个Ab限制性的CD4+T细胞表位,可以激发机体产生针对弓形虫特异性的免疫反应。弓形虫根据其毒力的差异可主要分为三个克隆谱系。Ⅰ型、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅱ型虫株通常与人类疾病有关,Ⅲ型虫株似乎在动物身上更为常见。上述这几个表位中的大多数在Ⅰ型和Ⅱ型虫株之间是高度保守的。弓形虫的生活史非常复杂,因此我们选择了 B细胞表位(SAG1 82-102或SAG1 301-320),CD8+T 细胞表位(HF10 或 ROP7)和 CD4+T 细胞表位(AS15)作为弓形虫多抗原肽疫苗的候选表位肽。虽然MAP疫苗具有诸多优势,但是也并非没有缺点。例如,肽段本身的免疫原性不是很强,需要递送系统或佐剂的帮助。而且它们跟天然折叠的蛋白质相比,非常容易受到酶促降解的影响,缺乏稳定性。因此,为上述多抗原肽疫苗寻找合适高效的载体变的尤为重要。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由病毒的结构蛋白形成的多种纳米颗粒(大小为20-100nm直径),并且可以在体外自我组装。它们类似于病毒,但是由于缺乏病毒的遗传物质,不能在机体内复制,因而没有传染性。VLPs模拟了天然病毒的三维构象,可在其表面递呈高密度重复的外源抗原表位,从而诱导机体产生所需的体液和细胞免疫反应。近年来,VLPs已是生产传染病疫苗载体的绝佳选择,已经有多种VLPs疫苗投入市场使用。然而,目前对弓形虫的VLPs疫苗的研究还非常少,需要更多的努力来填补这一具有广阔发展前景的研究领域的空白。乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBc)作为VLPs平台已被广泛应用多年。它可在许多重组基因表达系统中高度表达,包括原核表达系统,并且易于在体外自我组装。HBc颗粒的表面具有位于“刺突”顶端的主要免疫显性区域(Major immune dominant region,MIR),作为载体这种结构不仅能保持外源B细胞构象表位正确的空间构象,而且可以通过高度重复、适当间隔的方式呈现外源的构象和线性表位,能够极大地改善其颗粒表面上递呈的外源抗原表位的免疫原性。多种来自细菌、病毒和原生动物的外源抗原已被插入到HBc颗粒中构建了 HBc-抗原融合蛋白,其中的一些已达到临床试验阶段。鉴于此,将弓形虫多抗原肽加载到HBc颗粒上构建的嵌合VLPs疫苗,有望发展成一种经济高效的抗虫疫苗。研究目的1、将构象B细胞表位,Ld限制性CD8+T细胞表位和Ab限制性CD4+T细胞表位加载到HBc病毒样颗粒上,以探索这种新型弓形虫疫苗制剂方案的可行性。2、通过急性和慢性弓形虫小鼠感染模型全方面地评估此嵌合HBc病毒样颗粒疫苗产生的抵抗弓形虫感染的免疫保护力。研究方法1、构建、纯化及鉴定嵌合HBc病毒样颗粒本研究将弓形虫CD8+T细胞表位(HF10或ROP7)和B细胞表位(SAG182-102或SAG1301-320)的基因序列插入到截断HBc颗粒HBcΔ 78和79位氨基酸的基因序列之间,两端加上谷氨酰胺(Q)和天冬氨酸Asp(D)的连接子,再将CD4+T细胞表位(AS15)加在HBcΔ的C端末尾,这些复合基因与原核表达质粒pET-30a(+)连接后,构建了嵌合HBc病毒样颗粒的重组质粒:pET-30a(+)/HBcΔ,HBcAH82,HBcAH301,HBcAR82和HBcΔR301。重组质粒经过扩增和鉴定后,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达后,收集嵌合的HBc病毒样颗粒蛋白(HBcΔ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcΔR82和HBcΔR301)。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定目的蛋白,并分析是可溶性蛋白还是包涵体沉淀。诱导嵌合HBc病毒样颗粒大量表达后,对以可溶性状态存在的HBcΔ蛋白直接通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化,透析浓缩后收集目的蛋白;而对以包涵体沉淀状态存在的嵌合蛋白HBcΔH82,HBcAH301,HBcAR82和HBcΔR301,则先要通过含有尿素的裂解液溶解包涵体沉淀,通过镍柱纯化后,再进行梯度透析复性,从而得到正确折叠组装的嵌合HBc病毒样颗粒。嵌合HBc病毒样颗粒都含有His-Tag标签蛋白,可以与His单克隆抗体结合,并通过蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)鉴定出来。最后通过透射电镜观察分析嵌合HBc病毒样颗粒是否形成二十面体的病毒结构。2、评估嵌合HBc病毒样颗粒疫苗的免疫原性使用凝胶法鲎试剂检测嵌合蛋白中内毒素的含量。合成含有CD8+T细胞表位(HF10 或 ROP7),B 细胞表位(SAG182-102 或 SAG1301-320)和 CD4+T 细胞表位(AS15)的四个复合抗原表位肽,即H82,H301,R82和R301。将BALB/c实验小鼠随机分成10组,每组23只小鼠,分别在小鼠皮下多点注射50μg重组蛋白(HBcΔ,H82,HBcΔH82,H301,HBcΔH301,R82,HBcΔR82,R301,HBcΔR301)或者50μl的PBS缓冲液。疫苗接种每隔两周加强一次,一共进行3次接种。在首次免疫后0,2,4和6周分别采集免疫小鼠的血清,通过ELISA检测其血清中IgG抗体水平,利用第一次免疫后6周收集的血清测定小鼠IgG1和IgG2a水平。同时每组取3只小鼠制备脾细胞悬液,通过流式细胞术检测其脾细胞中CD4+和CD8+T淋巴细胞分别占的比例,另外将脾细胞经过重组蛋白或ConA刺激后,收集细胞的培养上清液,用ELISA试剂盒检测其细胞因子IL-2和IL-4(培养24h),IL-10(培养 72h),IFN-γ(培养 96h)的浓度。在末次免疫后2周,将每组10只小鼠腹腔注射200个弓形虫RH株速殖子攻击感染,每日密切观察实验小鼠的状态,准确记录各组小鼠的死亡日期,并绘制相应的生存曲线。每组另外的10只小鼠以灌胃的方式口饲感染30个PRU株包囊,每天观察小鼠的状态,45日后,取出它们的脑组织制备脑匀浆,光学显微镜下观察并估算出每只小鼠脑内的包囊数。结果1、嵌合HBc病毒样颗粒构建成功通过重组质粒(pET-30a(+)/HBcΔ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcΔR82 和 HBcΔR301)的双酶切和琼脂糖凝胶电泳实验的鉴定,发现复合的嵌合HBc病毒样颗粒的基因片段已经正确地插入到原核表达质粒pET-30a(+)中,表明重组质粒构建成功。无论是可溶性蛋白HBcΔ,还是包涵体蛋白HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82和HBcΔR301,都通过Ni-NTA琼脂糖凝胶获得了较高纯度的嵌合HBc病毒样颗粒蛋白。通过Western Blot和透射电镜分析,表明携带His标签的弓形虫嵌合HBc VLPs在原核表达系统中表达成功,并且可以在体外组装成完好的病毒样颗粒,嵌合的HBc病毒样颗粒蛋白(HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82和HBcΔR301)形成了类似于原始非嵌合HBc病毒样颗粒(HBcΔ)的二十面体形态,保证了弓形虫的B细胞表位维持了其正确的空间构象,并且密集均匀地在颗粒表面呈现了虫体来源的所有抗原表位,这为接下来其诱导小鼠产生弓形虫特异性的体液和细胞免疫应答打牢物质基础。2、嵌合HBc病毒样颗粒疫苗具有很强的免疫保护性早在第二次免疫接种后,用HBcΔH82和HBcΔR82蛋白免疫的小鼠就可以检测到明显升高的IgG抗体水平(p<0.01);在第三次接种后,这两种蛋白质更是诱导了最高的IgG抗体水平(p<0.001)。与对照组相比,只有用HBcΔH82蛋白免疫的小鼠同时具有较高的IgG1和IgG2a抗体滴度(p<0.05)。此外几乎所有的免疫组小鼠的血清中IgG1/IgG2a的比值都小于1,以上结果说明嵌合HBc病毒样颗粒疫苗在实验小鼠体内诱导了以Th1型为主的特异性免疫应答。用含有弓形虫CD4+T细胞表位(AS15)的重组蛋白(H82,HBcΔH82,H301,HBcAH301,R82,HBcΔR82,R301和HBcAR301)免疫的小鼠脾细胞中CD4+T细胞的数量较对照组都有明显的增高(P<0.05),尤其是当其加载到HBc病毒样颗粒上之后(p<0.01)。除了接种PBS和HBcΔ的小鼠,其它重组蛋白免疫的小鼠体内CD8+T细胞的含量都有不同程度的增加,特别是对于用含有HF10表位的嵌合HBc病毒样颗粒(HBcAH82和HBcΔH301)免疫的小鼠(p<0.001)。用重组蛋白 HBcΔH82 和 HBcAH301(p<0.001),HBcΔR82 HBcΔR301(p<0.01)以及复合抗原表位肽(H82,H301,R82和R301)(p<0.05)免疫的小鼠脾细胞培养上清液中IFN-y的水平均明显高于对照组。用HBcΔH82(p<0.001)和HBcΔH301(p<0.01)疫苗接种的小鼠具有更高的IL-2水平。而对于IL-4和IL-10,仅在用HBcΔH82蛋白免疫的小鼠中观察到了轻微升高的细胞因子浓度。用嵌合 HBc 病毒样颗粒 HBcΔH82(15.6±3.8 天)(χ2=20.13,p<0.001),HBcΔH301(8.1±1.5 天)(χ2=14.09,p<0.01),HBcΔR82(8.8±1.3 天)(χ2=17.83,p<0.001)和HBcΔR301(6.6±1.2天)(χ2=4.32,p<0.05)接种的小鼠的生存时间较对照组小鼠均有一定程度的延长,尤其是HBcAH82蛋白,甚至观察到最长20天的存活时间。用 HBcAH82(1454±239;p<0.01)和 HBcAH301(173 0±230;p<0.05)蛋白接种的小鼠具有比对照组小鼠(2091±263)显著减少的脑内包囊数量,包囊的减少率分别为30.5%和17.3%。结论1、嵌合 HBc 病毒样颗粒(HBcδ,HBcΔH82,HBcAH301,HBcΔR82 和 HBcδR301)可以在大肠杆菌中成功表达出与非嵌合得HBc病毒样颗粒(HBcΔ)相似的二十面体的病毒结构,正确且密集地在病毒颗粒表面呈现弓形虫的构象B细胞表位和线性T细胞表位。2、嵌合 HBc 病毒样颗粒(HBcδ,HBcΔH82,HBcΔH301,HBcδR82 和 HBcΔR301)疫苗具有很强的免疫原性。特别是用HBcΔH82蛋白免疫接种的小鼠体内产生了强烈的虫体特异性的体液和细胞免疫应答,起到了抵抗急性和慢性弓形虫病的作用,是一种全新有效的抵抗弓形虫感染的疫苗制剂方案。创新性和意义创新性:本研究首次构建了含有弓形虫SAG1构象B细胞表位的疫苗,并且首次将含有构象B表位,Ld限制性CD8+T细胞表位和Ab限制性CD4+T细胞表位的多抗原肽疫苗加载到乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒上,证明了弓形虫的这种新型疫苗制剂是可以构建成功的。意义:本研究提供了一种全新有效的对抗弓形虫感染的疫苗制剂方案,可以对研发安全、有效、经济、保护力强的弓形虫疫苗提供重要参考,为弓形虫病的防治奠定理论和实验基础。