目的:自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统的效应细胞,可在没有预先致敏或识别呈递抗原的情况下快速杀伤癌细胞或病毒感染的细胞,NK细胞亦可产生众多细胞因子,包括干扰素-γ（IFN-γ）,肿瘤坏死因子（TNF-α）等,从而发挥抗病毒、抗肿瘤的能力。NK细胞发挥效应功能与否主要取决于细胞表面免疫调控受体（包括活化性受体与抑制性受体）之间信号的动态平衡。目前,关于NK细胞免疫调控受体的研究已逐渐受到广泛的重视,CD160作为可以活化NK细胞功能的免疫调控受体在癌症领域已有相关报道,然而在HIV感染者中,免疫调控受体CD160在NK细胞上的表达、与疾病进展的关联、对NK细胞功能的影响以及发挥功能的内在机制均未见报道。本文首次研究免疫调控受体CD 160在HIV感染者NK细胞表面的表达、并分析了 CD160与HIV疾病进展的关系,及导致CD160表达变化的原因（论文一）;并进一步通过转录组学研究了 CD160对NK细胞功能的影响,并在体外验证了 CD160可以增强HIV感染者NK细胞的增殖和细胞因子的产生等功能（论文二）;在相关机制研究中,首次证明CD160可以通过PI3K/AKT/mTOR/s6k促进NK细胞的糖代谢进而促进NK细胞功能（论文三）,以期为HIV的临床治疗提供新的思路以及靶点。研究方法:1、研究对象本次研究共纳入研究对象251例,包括77例健康对照者,121例未治疗HIV感染者,53例接受抗逆转录病毒治疗（anti-retroviral therapy,ART）后的HIV感染者。健康对照人群为HIV抗体阴性人群,年龄与性别与HIV感染人群相匹配,且无免疫系统疾病。中国医科大学附属第一医院红丝带门诊招募本次研究的HIV感染者。本次研究通过中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准,以上所有研究对象均签署知情同意书。2、CD4+T细胞绝对值计数研究对象的外周静脉血是由含EDTA的真空采血管采集而来,分别向绝对计数管中加入20 μLTriTEST CD4/CD8/CD3混合染料,然后添加50 μL的抗凝全血,室温避光染色15 min,添加450 μL免洗溶血素,室温避光条件下反应15 min。BD Calibur流式细胞仪进行检测,MultiSET软件检测进行计算分析,得出CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞各亚群绝对计数和对应的比值。3、HIV病毒载量检测采集研究对象的全血并分离出1.2 mL的血浆用于检测。检测方法是实时定量PCR（Real time PCR,RT-PCR）,检测仪器是由美国Roche公司提供的COBAS AMPLICOR自动载量仪。4、外周血单个核细胞的提取密度梯度离心法提取外周血单个核细胞PBMCs,PBS稀释混匀研究对象外周静脉血,缓慢加入到Ficoll液面上层,离心之后缓慢吸取细胞层并使用PBS洗涤两次。5、多种细胞表面标志物表达检测采集研究对象1-2 mL全血并提取PBMCs进行表面染色:用CD3-APC-cy7、LIVE/DEAD-Percp、CD 14/CD19-Percp-cy 5.5、CD 16-APC、CD56-PE-cy7、CD 160-PE、TIGIT-BV421荧光抗体对NK细胞表面的CD160、TIGIT进行染色;使用CD3-APC-cy7、LIVE/DEAD-Percp、CD14/CD19-Percp-cy5.5（排除 B 细胞和单核细胞）、CD16-APC、CD56-PE-cy7、CD39-BV421对NK细胞表面的活化标记物CD69进行表面染色;使用 CD3-APC-cy7、LIVE/DEAD-Percp、CD14/CD19-Percp-cy5.5、CD16-APC、CD56-PE-cy7、CD36-PE、CD71-APC、CD98-BV510、GLUT1-AlexaFluor（?）488 对NK细胞表面脂质转运受体CD36、转铁蛋白受体CD71、氨基酸转运受体CD98、葡萄糖转运受体GLUT1进行表面染色。加入荧光抗体后,4℃避光染色30min,用含2%FBS的PBS洗去多余未结合的荧光抗体染料,加入200 μL PBS后Vortex混匀细胞后上机检测。流式细胞仪所得原始实验结果用Flow Jo software v10软件分析。6、NK细胞产生IFN-γ、TNF-α的检测采集研究对象全血8-10 mL,提取PBMCs并计数,96孔板上设置检测孔和对照孔,每孔细胞数保持0.5 million左右,按照0.5 million/200μL/孔将细胞种植于96 孔板上,检测孔使用 10 ng/mL 的 IL-12,50ng/mL 的 IL-15,100 ng/mL 的 IL-18刺激细胞,未接受细胞因子刺激的孔设置为阴性对照孔。于37℃,含5%CO2的培养箱中孵育24小时,18小时加入Golgistop。培养结束后收细胞并用PBS洗涤细胞,加入1 mLPBS后加入1 μL LIVE/DEAD,4℃避光染色30 min,清洗细胞后加入细胞表面标志物的荧光抗体染料CD3-APC-cy7、CD14/CD19-Percp-cy5.5、CD16-APC、CD56-PE-cy7、CD160-PE,4℃避光染色30 min后开始破膜,每管加入细胞破膜试剂,Vortex后4℃避光破膜30 min后,破膜洗液洗细胞,对应管加入IFN-γ-AlexaFluor（?）488,TNF-α-BV421,4℃避光染色30 min后用破膜洗液清洗细胞,弃上清,补充200 μL PBS重悬细胞,使用BD FACS Canto Ⅱ细胞仪检测。7、NK细胞Ki67的检测提取PBMCs计数细胞、24小时培养细胞、染死活染料及表面标志物如步骤6所述,然后PBS清洗细胞两次后,弃上清开始破核处理,每管加入1mL的破核试剂（concentrate:diluent 1:3配置后使用）Vortex混匀细胞后,4℃避光破核45 min后加入2 mL 1×破核洗液（Solution洗液:DI水1:9稀释后使用）洗细胞两次（500 g,5 min）,弃上清,加入Ki67-BV421,4℃避光染色30 min后用破核洗液清洗细胞（500 g,5 min）,弃上清,补充200 μL含2%FBS的PBS重悬细胞,使用BD FACS Canto Ⅱ细胞仪检测。8、NK细胞葡萄糖摄取（2-NBDG）的检测荧光葡萄糖类似物2-NBDG（Invitrogen）用于测量NK细胞葡萄糖摄取。将分离的细胞重新悬浮在已预热（37℃）的无葡萄糖培养基（Life Technologies）中,加入3.4 μL溶解的2-NBDG溶液,在37℃下孵育30 min并用PBS清洗细胞（300 g,10 min）。在通过流式细胞术检测之前,用表面标记（CD3、CD14、CD19、CD16、CD56 和 CD160）标记细胞。9、激活CD 160检测NK细胞产生IFN-γ的实验采集研究对象全血1-2 mL,提取PBMC并计数,R10重悬细胞并按照0.5 million/200μL/孔将细胞种植于检测孔和对照孔,检测孔加入10 μg/ml的CL1-R2和细胞因子混合刺激物（IL12+IL15+IL18）,阴性对照孔加入相同细胞因子混合刺激物及对应的mIgG对照,24小时培养细胞、染死活染料和表面标志物以及破膜和胞内染色如步骤6所述。10、外源性葡萄糖对NK细胞表面GLUT1表达及功能影响的实验（1）外源性葡萄糖对NK细胞表面GLUT1表达的影响采集研究对象全血1-2 mL,提取PBMC并计数,R10重悬细胞并按照0.5 million/200μL/孔将细胞种植于检测孔和对照孔,检测孔加入10 mmol/L的葡萄糖和细胞因子刺激物（IL12+IL15+IL18）,阴性对照孔加入相同的细胞因子刺激物,24小时培养细胞、染死活染料及表面标志物如步骤6所述。（2）外源性葡萄糖对NK细胞产生IFN-γ的影响采集研究对象全血8-10 mL,提取PBMC并计数,R10重悬细胞并按照0.5 million/200μL/孔将细胞种植于检测孔和对照孔,检测孔加入10 mmol/L的葡萄糖和细胞因子混合刺激物（IL12+IL15+IL18）,阴性对照孔加入相同的细胞因子刺激物,24小时培养细胞、染死活染料和表面标志物以及破膜和胞内染色如步骤6所述。11、磷酸化染色负选研究对象NK细胞,将PhosflowTM Fix Buffer Ⅰ加热至37℃,将BD PhosflowTM Perm Buffer Ⅲ置于-20℃冰箱冷却备用。将NK细胞均分三份,一份置于200 μL R10中（用于流式上机卡门）,一份加入10 mmol/L的CL1-R2用于对照,一份加入相同浓度的mIgG用于对照,温箱孵育30 min,立即加入200 μL温热的PhosflowTM Fix Buffer Ⅰ,Vortex混合均匀置于37℃水浴10 min,孵育结束后用2%FBS的PBS离心细胞,然后加样枪吸出上清液;混匀细胞,然后缓慢加入200 μL冰冷的 BD PhosflowTM Perm Buffer Ⅲ通透细胞,冰上孵育 30 min,2%FBS 的 PBS洗涤细胞两次,接着加入磷酸化染料mTOR-PE,AKT-BV421,s6k-Alexa Fluor（?） 488,4℃避光染色30min,用PBS（含2%的FBS）清洗细胞弃上清,补充200μL的PBS,Vortex混匀细胞上流式细胞仪检测。12、血浆TGF-β1的检测收集研究对象（包括HIV感染者和阴性对照者）的血浆,置于-80℃冰箱冻存,用检测缓冲液（1x）以1:10稀释血浆,20 μL 1NHC1酸化稀释的样本,室温孵育1小时,20 μL 1N NAOH中和酸化的样本后,Elisa检测两组人群血浆TGF-β1水平。13、体外TGF-β1干预CD160实验及血浆封闭TGF-β1检测CD160采集研究对象1-2mL全血,提取PBMCs并计数,使用R10按照0.5 million/200μL/孔孵育对应的PBMCs,检测孔加入10 ng/ml的TGF-β1,在37℃和5%CO2的培养箱中孵育24小时后收细胞、染死活染料、洗细胞并染表面如前所述。收集研究对象血浆并按照0.5 million/200μL/孔孵育对应的PBMCs,检测孔加入anti-TGF-β1,阴性对照孔加入mIgG,以及单纯使用血浆孵育PBMCs的对照孔,在37℃和5%CO2的培养箱中孵育24小时后收细胞、染死活染料、洗细胞并染表面如前所述。14、统计学分析流式细胞仪所得原始结果使用FlowJo 10.4（Ashland,OR,USA）软件进行分析。所有数据分析均使用Prism 9.0版（GraphPad Software,USA）软件进行。统计分析过程中首先对实验数据进行正态分布检验,发现均符合非参数分布。非参数Mann-WhitneyU检验用于比较两组之间定量数据的差异,Wilcoxon配对检验用于两组之间配对秩和检验,检验均为双侧检验,p＜0.05（双尾）被认为存在显著的统计学差异。结果:一、HIV感染者NK细胞免疫调控受体CD160表达及与疾病进展相关性1、发现CD 160在HIV感染者NK细胞表达降低本次研究通过多色流式实验检测研究对象NK细胞免疫调控受体CD160的表达,发现HIV感染者NK细胞表面CD160的百分比以及平均荧光强度相较健康对照人群发生明显下调。此外,HIV感染者NK细胞的三个亚群CD56bright、CD56dimCD16+、以及CD56-CD16+上CD160的百分比以及平均荧光强度也发生不同程度的下降。2、发现CD160主要表达在HIV感染者NK细胞CD56-CD16+亚群上通过对CD160在NK亚群上的分布,我们发现在健康对照人群中,CD160主要分布在CD56dimCD16+亚群上,而在HIV感染者中,CD160的百分比和平均荧光强度主要分布在CD56-CD16+亚群上。3、发现CD160在NK细胞上的表达与HIV疾病进展呈负相关进一步分析NK细胞上CD160与HIV感染者体内的病毒载量水平与CD4+T淋巴细胞绝对计数的相关性,发现CD 160在NK细胞上的表达（包括百分比与平均荧光强度）既与HIV的病毒载量呈负相关,亦与CD4+T淋巴细胞绝对计数呈正相关,总体与HIV疾病进展呈负相关。4、发现HIV感染者CD160+TIGIT+NK和CD160TIGIT+NK细胞百分比与HIV疾病进展呈负相关进一步引入高表达于NK细胞上重要抑制性受体TIGIT,发现CD160+TIGIT+NK和CD160TIGIT+NK细胞的百分比与HIV感染者体内病毒载量水平呈负相关,与CD4+T淋巴细胞绝对计数呈正相关,总体与HIV疾病进展呈负相关。5、发现HIV感染者血浆中TGF-β1水平升高,并可抑制NK细胞CD160分子的表达TGF-β1作为一种细胞因子,在机体内发挥一定程度上的的免疫抑制作用,我们验证了 HIV感染者血浆中TGF-β1水平较健康对照人群明显升高,且发现其在血浆中的表达水平与HIV感染者外周血NK细胞表面的CD160表达呈明显负相关;接着通过体外实验验证TGF-β1可明显抑制其NK细胞上CD160的表达,并且在血浆中加入anti-TGF-β1后可恢复NK细胞上CD160的表达。二、HIV感染者CD160+NK细胞功能的研究1、CD160对于NK细胞发挥免疫应答起到重要作用。通过转录组学分析,我们发现CD160-/+两群NK细胞的差异基因主要富集在免疫应答及信号传导的通路上,意味着CD160对于NK细胞发挥免疫功能起到重要作用,为我们后续功能研究奠定基础。2、HIV感染者CD 160+NK细胞活化水平较高本次研究通过多色流式实验检测HIV感染者CD160-/+两群NK细胞表面细胞活化标志物CD69的表达情况,发现CD160+NK细胞表面CD69的百分比和平均荧光强度较CD160-NK细胞明显升高,证明CD160对于NK细胞活化的促进作用。3、HIV感染者CD160+NK细胞增殖能力较强HIV的感染可造成NK细胞功能上的耗竭,故HIV的疾病进展情况与NK细胞功能受损密切相关,且CD160在HIV感染者NK细胞表面降低,基于此,我们通过GSEA富集分析发现MKI67通路相关基因主要富集在CD 160+NK细胞,然后我们分析了 HIV感染者CD160-/+NK细胞两群细胞核内增殖标志物Ki67的表达情况,发现CD160+NK细胞核内Ki67的百分比和平均荧光强度较CD160-NK细胞显著升高,且CD160在NK细胞上的表达与Ki67核内的表达呈正相关,证明CD160对于NK细胞增殖能力的促进作用。4、HIV感染者CD160+NK细胞细胞因子产生功能较强NK细胞可以产生细胞因子IFN-γ和TNF-α进而抗病毒、抗肿瘤,我们通过GSEA富集分析发现IFNG通路相关基因主要富集在CD160+NK细胞,因此我们通过实验验证CD160+NK细胞产生IFN-γ的水平较CD160-NK显著升高,且关于TNF-α,我们也得出相同的结论;此外,我们进一步分析发现CD160在HIV感染者NK细胞表面的表达情况分别与IFN-γ和TNF-α的产生水平呈正相关,且特异性活化CD160可显著提升NK细胞产生IFN-γ的能力。三、HIV感染者CD 160+NK细胞糖代谢水平及相关信号通路研究1、RNA-seq结果显示PI3K/AKT/mTOR/s6k通路基因主要富集在CD160+NK细胞鉴于CD160可以增强HIV感染者NK细胞的功能,因此我们试图深入探究CD160影响NK细胞功能的机制,我们首次通过转录组GSEA富集分析发现,PI3K/AKT/mTOR/s6k作为影响糖代谢的重要通路之一,其通路基因主要富集在CD160+NK细胞,因此,我们推测CD160可能是通过PI3K/AKT/mTOR/s6k促进糖代谢水平,进而促进HIV感染者NK细胞效应功能。2、体外验证CD160通过PI3K/AKT/mTOR/s6k促进NK细胞功能基于GSEA分析作出的推测,我们试图体外实验加以验证,通过体外CD160激活抗体特异性活化CD160,我们发现AKT,mTOR以及s6k的磷酸化水平得到了显著提升,同时GLUT1在NK细胞上的表达也得到了显著提高,结合之前特异性活化CD160验证其对NK细胞功能的促进作用,我们证明了 CD160通过PI3K/AKT/mTOR/s6k 增强 NK 细胞功能。3、CD 160与NK细胞糖代谢水平密切相关代谢作为免疫细胞重要功能途径,在协助细胞发挥功能的过程起着非常重要的作用,我们发现HIV感染后NK细胞表面GLUT1的表达受到了明显的抑制,进而我们证明CD160+NK细胞GLUT1的表达明显升高,且NK细胞上的CD160与GLUT1表达呈正相关,此外我们也证明了 CD160+NK细胞糖摄取水平（2-NBDG）显著升高,且NK细胞上的CD160与糖摄取类似物2-NBDG明显正相关,因此CD 160与NK细胞糖代谢水平密切相关。4、外源性葡萄糖显著增强CD160+NK细胞功能基于以上研究成果,我们体外培养NK细胞并给予葡萄糖,发现NK细胞产生IFN-γ的能力显著提升,此外,通过2-DG抑制糖代谢亦可明显下调NK细胞产生IFN-γ的能力,充分验证了糖代谢是NK细胞重要的供能代谢途径;我们进一步发现,无论是体外给予外源性葡萄糖进而增强NK细胞功能,亦或是2-DG抑制糖代谢进而下调NK细胞的功能,CD160+NK细胞产生IFN-γ水平受到影响的程度均显著高于CD160-NK细胞,基于此,我们认为CD160通过糖代谢进而促进NK细胞功能。结论:1、首次发现HIV感染者NK细胞及亚群上CD160表达明显下降,且与HIV疾病进展呈负相关。2、首次发现HIV感染者体内升高的TGF-β1是抑制NK细胞上CD160表达的重要原因。3、首次发现HIV感染者体内NK细胞表面的CD160可促进其功能,且特异性活化CD160可增强NK细胞的功能。4、首次发现CD160通过PI3K/AKT/mTOR/s6k信号通路促进HIV感染者NK细胞的糖代谢水平进而增强NK细胞功能。