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太瑞斯梭孢壳霉(Thilavia terrestris)是一株嗜热丝状真菌,具有产木质纤维素水解酶类的能力,其所产酶的温度耐受性良好,应用前景比较广泛。与降解木质纤维素的重要菌种里氏木霉(Trichoderma reesei)相比,它含有的糖苷水解酶种类更为丰富。目前,利用丝状真菌表达蛋白一般在木霉属、曲霉属等常温菌种中进行,而耐热真菌不仅产酶快、分解效率高,还能产生热稳定性高的纤维素与半纤维素降解酶,具有常温菌无法比拟的优势。本工作的主要目的是对太瑞斯梭孢壳霉产酶进行产纤维素酶的条件进行优化,以提高其产酶能力,其次比较太瑞斯梭孢壳霉糖代谢途径的相关酶基因的相对表达水平,从中筛选出强组成型启动子,然后利用高活性的启动子构建太瑞斯梭孢壳霉组成型表达系统,并进行一些有价值蛋白的表达,如木聚糖酶的表达。对一株嗜热子囊真菌——太瑞斯梭孢壳霉进行产酶条件优化。优化前采用CMC-Na产酶发酵培养基,通过正交试验,优化后确定以2.5%的麦麸、2.0%的黄豆饼粉,初始p H值为4.0为太瑞斯梭孢壳霉的最佳产酶条件,测得滤纸酶活较优化前提高了44.8%,达到了1.39 U·m L-1。正交实验方差分析的结果表明,氮源对太瑞斯梭孢壳霉发酵产酶活性影响显著。该菌株所产酶在60℃~80℃仍保持较好的热稳定性。通过RT-q PCR对太瑞斯梭孢壳霉糖代谢途径的131个相关酶基因进行了初筛,获得18个较高转录水平的酶基因并进行相对定量分析,结果显示,这18个基因的转录水平在葡萄糖浓度为10g/L的条件下达到最高;当超过该浓度时,其中3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)、丙酮酸脱羧酶(pdc)、顺乌头酸酶(Acn A)、异柠檬酸脱氢酶(idh-1、idh-2)、丙酮酸脱氢酶(pdh-1、pdh-2、pdh-3)、丙酮酸激酶(pyk)、琥珀酸脱氢酶(sdh B、sdh C)、琥珀酰辅酶A合成酶(succinyl Co A synthetase)、醛缩酶(fba-1、fba-1)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、糖原结合域(gbm)的表达水平随葡萄糖浓度升高而下降;不同葡萄糖浓度下,gpd基因的相对表达水平远高于其它基因。该结果同时说明了太瑞斯梭孢壳霉糖代谢相关酶基因的表达水平受到葡萄糖的影响。使用PCR分别扩增太瑞斯梭孢壳霉gpd基因启动子序列(Pgpd)、终止子序列(Tgpd)以及编码木聚糖酶基因(xyn)序列,然后使用双酶切连接的方式将三个片段依次连接到p UC19质粒上,得到p UC19-Pgpd-xyn-Tgpd表达盒。将构建好的表达盒与携带筛选标记基因的p AN7-1质粒一起共转化太瑞斯梭孢壳霉,在160μg/m L潮霉素浓度的抗性平板上筛选转化子,双引物验证法获得了一个转化株。测定重组菌株的木聚糖酶酶活,发现跟原菌株没有差异,说明转化菌株未正常表达目的蛋白。本工作优化了一株嗜热子囊真菌的产酶发酵培养基,使酶活得到了提高;分析了太瑞斯梭孢壳霉糖代谢途径的酶基因相对表达水平,获得了一个潜在的强启动子Pgpd,并用该启动子尝试构建太瑞斯梭孢壳霉组成型表达系统,虽未获得表达,但对后续的研究提供了参考。