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目的：探讨鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci, Cps)T3SS分泌蛋白SINC与宿主细胞自噬和凋亡的关系以及MAPK/ERK信号通路在其中的调控作用，有助于进一步阐明Cps致病机制。
方法：构建pET-30a(+)/SINC重组质粒，并转化E.coliBL21菌株，0.1mMIPTG诱导表达并纯化获得SINC蛋白。BCA法测定SINC重组蛋白浓度，并经多粘菌素B去内毒素处理。westernblot检测不同浓度(2、4、6、8、10μg/ml)的SINC刺激HeLa细胞和RAW264.7细胞24h和最佳浓度SINC刺激两种细胞不同时间(0、6、12、24、36h)后自噬蛋白LC3-II、Becin-1、Bax和Bcl-2的水平，并用间接免疫荧光法检测SINC蛋白刺激两种细胞后LC3的水平，透射电镜检测自噬特殊结构，Hoechst33258染色检测细胞凋亡率。用最佳浓度SINC刺激两种细胞不同时间(0、5、15、30、60、120min或者0、6、12、18、24、36h)后，westernblot检测ERK1/2的磷酸化；用50μMERK1/2抑制剂U0126预处理两种细胞后1h，再用最佳浓度SINC蛋白刺激两种细胞最佳时间后，用间接免疫荧光检测LC3的水平，Hoechst33258染色和流式细胞术检测细胞凋亡率，并用westernblot检测LC3-II、Becin-1、SQSTM1、Bax、Bcl-2和PARP的表达水平，。
结果:成功构建pET-30a(+)/SINC原核表达载体，诱导表达纯化得66KDa左右的目的蛋白SINC。westernblot检测结果显示，4μg/mlSINC蛋白刺激HeLa细胞6h时LC3-II和Becin-1的表达水平达到峰值；间接免疫荧光检测发现SINC刺激后可使细胞内LC3荧光斑点数明显增多，透射电镜下可见更多的自噬小体和自噬溶酶体。用鼠巨噬细胞RAW264.7细胞重复此实验，发现当SINC浓度达2μg/ml，刺激时间为12h时，自噬相关指标变化最明显。4μg/mlSINC蛋白刺激HeLa细胞15min时，p-ERK1/2/ERK1/2比值明显上调；加入抑制剂U0126后，LC3-II、Becin-1和SQSTM1表达下调，LC3-II荧光斑点聚集减少。而2μg/mlSINC蛋白刺激RAW264.7细胞15min时p-ERK1/2/ERK1/2比值明显上调；加入抑制剂U0126后，LC3-II和Becin-1表达下调且SQSTM1表达上调，LC3-II荧光斑点聚集减少。10μg/mlSINC蛋白刺激HeLa细胞18h后细胞凋亡率最低，且Bax/Bcl-2比值最低。10μg/mlSINC蛋白刺激HeLa细胞18h后p-ERK1/2/ERK1/2比值明显上调。加入抑制剂U0126后，Hoechst33258染色和流式结果表明：SINC作用的细胞凋亡率(2.51%)显著低于未处理细胞(4.53%)，也可使STS诱导的细胞凋亡率下降6.99%；而再加入U0126后，仅使细胞凋亡率下降3.68%。不管是否加入STS诱导细胞凋亡，SINC作用可使宿主细胞中Bax下调，Bcl-2上调，Bax/Bcl-2比值降低和CleavedPARP表达量显著降低。而加入U0126后，Bax下调，Bcl-2下调，Bax/Bcl-2比值降低和CleavedPARP表达量显著增加。
结论:SINC蛋白通过激活MAPK/ERK信号通路促进宿主细胞自噬和抑制宿主细胞凋亡。
方法：构建pET-30a(+)/SINC重组质粒，并转化E.coliBL21菌株，0.1mMIPTG诱导表达并纯化获得SINC蛋白。BCA法测定SINC重组蛋白浓度，并经多粘菌素B去内毒素处理。westernblot检测不同浓度(2、4、6、8、10μg/ml)的SINC刺激HeLa细胞和RAW264.7细胞24h和最佳浓度SINC刺激两种细胞不同时间(0、6、12、24、36h)后自噬蛋白LC3-II、Becin-1、Bax和Bcl-2的水平，并用间接免疫荧光法检测SINC蛋白刺激两种细胞后LC3的水平，透射电镜检测自噬特殊结构，Hoechst33258染色检测细胞凋亡率。用最佳浓度SINC刺激两种细胞不同时间(0、5、15、30、60、120min或者0、6、12、18、24、36h)后，westernblot检测ERK1/2的磷酸化；用50μMERK1/2抑制剂U0126预处理两种细胞后1h，再用最佳浓度SINC蛋白刺激两种细胞最佳时间后，用间接免疫荧光检测LC3的水平，Hoechst33258染色和流式细胞术检测细胞凋亡率，并用westernblot检测LC3-II、Becin-1、SQSTM1、Bax、Bcl-2和PARP的表达水平，。
结果:成功构建pET-30a(+)/SINC原核表达载体，诱导表达纯化得66KDa左右的目的蛋白SINC。westernblot检测结果显示，4μg/mlSINC蛋白刺激HeLa细胞6h时LC3-II和Becin-1的表达水平达到峰值；间接免疫荧光检测发现SINC刺激后可使细胞内LC3荧光斑点数明显增多，透射电镜下可见更多的自噬小体和自噬溶酶体。用鼠巨噬细胞RAW264.7细胞重复此实验，发现当SINC浓度达2μg/ml，刺激时间为12h时，自噬相关指标变化最明显。4μg/mlSINC蛋白刺激HeLa细胞15min时，p-ERK1/2/ERK1/2比值明显上调；加入抑制剂U0126后，LC3-II、Becin-1和SQSTM1表达下调，LC3-II荧光斑点聚集减少。而2μg/mlSINC蛋白刺激RAW264.7细胞15min时p-ERK1/2/ERK1/2比值明显上调；加入抑制剂U0126后，LC3-II和Becin-1表达下调且SQSTM1表达上调，LC3-II荧光斑点聚集减少。10μg/mlSINC蛋白刺激HeLa细胞18h后细胞凋亡率最低，且Bax/Bcl-2比值最低。10μg/mlSINC蛋白刺激HeLa细胞18h后p-ERK1/2/ERK1/2比值明显上调。加入抑制剂U0126后，Hoechst33258染色和流式结果表明：SINC作用的细胞凋亡率(2.51%)显著低于未处理细胞(4.53%)，也可使STS诱导的细胞凋亡率下降6.99%；而再加入U0126后，仅使细胞凋亡率下降3.68%。不管是否加入STS诱导细胞凋亡，SINC作用可使宿主细胞中Bax下调，Bcl-2上调，Bax/Bcl-2比值降低和CleavedPARP表达量显著降低。而加入U0126后，Bax下调，Bcl-2下调，Bax/Bcl-2比值降低和CleavedPARP表达量显著增加。
结论:SINC蛋白通过激活MAPK/ERK信号通路促进宿主细胞自噬和抑制宿主细胞凋亡。