基于SRAP分析冬凌草种质的遗传多样性

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冬凌草来自于唇形科Lamiaceae香茶菜属Isodon的碎米桠Isodon rubescens(Hemsl.) Hara。它绝大部分生长于长江流域和黄河流域,道地产区在济源太行山周边地区;冬凌草属阳性耐阴植物,略喜阴,抗寒性强,常生于林地、山坡、灌木丛、砾石地及路边等向阳处,冬凌草以全草入药。  近几年来,对冬凌草主要的特征性化学成分二萜类研究颇多,特别是ORI和 OGP-46,二者都具有明显的药理活性。郑州大学药学院关于冬凌草的课题组在长期研究济源市冬凌草时发现一个规律性的特殊现象:某些种群或个体中有 ORI,而有些含有 OGP-46。但是这两种二萜类主要成分不同时存在于同一植株内,并且从植株表面无法辨别。  化学成分存在的差异的现象在植物化学上被称为化学型。化学型本质是植物体内的次级代谢产物的差异,属于种内变异。化学型的产生是环境和遗传因素共同作用的综合产物,同时也与生长发育得各个阶段有关。  本论文主要从遗传因素中的基因组 DNA序列的碱基差异方面探究冬凌草出现该种内差异的可能原因。首先验证冬凌草的两种化学性等。结果显示:济源市的冬凌草可根据特征成分的不同分为两种类型:一类是含ORI的冬凌草,一类是含OGP-46的冬凌草,与预期的设想一致。  为了鉴定冬凌草的两种不同化学型,对不同采集地的6个冬凌草的种质资源进行遗传多样性的初步研究和分析,采用L49(75)正交试验设计对SRAP-PCR反应体系中影响扩增反应的5个因素(Mg2+,dNTPs,Taq DNA聚合酶,DNA模板,引物浓度)及退火温度进行优化。结果显示:冬凌草最佳的SRAP-PCR反应体系50ul中含模板 DNA20ng,5ul的10×PCR buffer,2mmol·L?1Mg2+的4.0ul,2000μmo l·L?1dNTPs1.0ul,Tag酶0.5U,正向和反向引物各1ul,dd H2O35.5ul;最佳退火温度为50℃。5个正向引物和6个反向引物共组成30个引物组合,其中有6对引物能够扩增出多态性条带,测序条带与NCBI数据库内的基因序列比对值为72.36%,相似度偏低;对两种不同化学型的冬凌草基因序列测序进行比对发现基因相似度介于16.74%~79.42%(PCR扩增条带大小相似的测序比对值介于78.46%~79.42%,差异较大的条带比对值介于16.49%~37.7%)。说明化学型不同的冬凌草基因序列具有较大的差异,并且 DNA信息不受繁殖方式及来源地的影响。从遗传因素角度为研究这种差异提供了一定的参考。冬凌草SRAP-PCR反应体系的优化和初步建立将为利用该标记进行种质遗传多样性分析和基因连锁图谱构建等研究提供技术支持。
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