嗜热链球菌是生产酸奶和硬质奶酪的主要发酵剂菌株,能利用牛乳中的乳糖和酪蛋白生成多种活性代谢产物,赋予产品特殊的质地、风味和营养价值。γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyricacid,GABA）是一种非蛋白质氨基酸,具有镇痛、抗焦虑、促进睡眠、抗炎症等诸多益生作用。很多嗜热链球菌能合成GABA,但其调控机制尚不清楚。此外,嗜热链球菌在生长和发酵过程中常遭受可利用氮源不足、低pH等胁迫压力,而GABA合成如何响应这些环境压力尚没有报道。为提高嗜热链球菌的GABA合成能力,本论文确定了嗜热链球菌的GABA合成基因簇,测定了在氮源匮乏和酸胁迫条件下GABA合成的特点;利用Pull-down、质谱、EMSA等技术鉴定GABA合成的调控因子;通过胞内蛋白质组学进一步分析细胞壁蛋白酶PrtS对GABA合成的促进作用及机制,为富含GABA酸奶的生产提供理论指导。取得具体标志性成果如下:1嗜热链球菌GABA合成基因簇的遗传组成及功能分析根据GenBank数据库中嗜热链球菌的基因组信息,发现GABA合成基因簇内存在谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD）的编码基因gadB和谷氨酸-GABA转运蛋白GadC的编码基因基因gadC以及各自的启动子PgadB和PgadC,但缺少调控因子GadR的编码基因;在gadBC基因簇两侧分别存在插入序列IS,预示着嗜热链球菌的GABA合成能力来自基因水平转移,这种独特的遗传组成不同于已报道的乳酸菌。测定了实验室保藏的41株嗜热链球菌的GABA合成能力和编码基因,发现37株菌携带有保守的gadBC基因簇,其中35株菌能够合成GABA。为了检测gadBC基因簇的功能,测定了嗜热链球菌SDMCC050242不同生长时期gadB和gadC两基因的转录水平,发现均可正常转录。比对上述37株菌中GAD的氨基酸序列,发现第81位氨基酸N81S的突变会导致酶失活,而氨基酸位点S147P、S385G、N433T、R452H的突变对GABA合成能力无影响;外源表达不同类型的gadBC基因簇,重组菌株得到相同的GABA合成能力,进一步说明嗜热链球菌的GABA合成属于组成型表达,其产量高低可能受控于环境压力或其它调控因子的影响。2嗜热链球菌中GABA合成调控因子的鉴定牛乳是一种缺少游离氨基酸的寡营养基质。嗜热链球菌为了在牛乳中快速生长,通常借助于氮代谢全局调控因子CodY促进碳骨架向氨基酸合成骨架的转化,为菌株生长提供所需的氨基酸。嗜热链球菌的GABA合成是否受到CodY调控尚不清楚。为了查明在牛乳中的GABA合成调控机制,以嗜热链球菌SDMCC050242为材料,利用DNAPull-down实验,筛选到能与gadB基因启动子PgadB结合的2个蛋白;LC-MS/MS鉴定分别是CodY和谷氨酰胺合成酶基因的抑制性调控因子GlnR。进一步研究发现codY基因的缺失引起gadB和gadC基因转录水平下调,GABA产量降低,表明CodY对GABA合成具有促进作用。EMSA结果进一步证实了 CodY直接与启动子PgadB和PgadC结合,从而发挥正调控作用。同样地,glnR基因的过表达引起gadB和gadC基因转录水平下调,导致GABA产量降低,显示GlnR的负调控作用。上述结果表明,嗜热链球菌细胞内的氮代谢调控因子参与GABA合成,CodY发挥正调控作用,GlnR发挥负调控作用。3嗜热链球菌细胞壁蛋白酶PrtS对GABA合成的促进作用细胞壁蛋白酶PrtS水解牛乳中的酪蛋白产生游离氨基酸和寡肽,为嗜热链球菌的生长提供速效氮源,但是只有部分嗜热链球菌携带prtS基因（PrtS+菌株）。为了研究PrtS在嗜热链球菌GABA生物合成中的作用,利用同源重组将SDMCC050242的prtS基因失活,发现突变株SDMCC050242ΔprtS的GABA产量下降了 79%,回补PrtS蛋白粗酶液后GABA产量恢复,证实了 PrtS对GABA合成的促进作用。利用蛋白质组学分析比较了野生株SDMCC050242及其突变株SDMCC050242ΔprtS胞内蛋白质组成的差异,发现PrtS的存在使得参与寡肽转运的蛋白和多种肽酶的丰度上调,而甲硫氨酸、丙氨酸和半胱氨酸等氨基酸合成酶的丰度下调,说明PrtS为菌株生长提供了大量的可利用氮源,从而抑制了菌体自身氨基酸的合成;通过RT-PCR分析相关基因及codY基因的转录水平,进一步验证了上述结果,表明在牛奶基质中PrtS通过提供可利用氮源满足菌株生长需求,并上调codY基因的转录,从而合成GABA。4甲硫氨酸对嗜热链球菌GABA合成的促进作用嗜热链球菌和德氏乳杆菌是酸奶发酵剂的主要菌株,由于长期依赖于德氏乳杆菌蛋白酶系统提供的氮源,嗜热链球菌自身合成氨基酸的部分基因丢失或退化为假基因,从而表现出不同的氨基酸营养缺陷型。为了进一步分析嗜热链球菌在牛奶基质中氨基酸合成能力的差异,比较了嗜热链球菌PrtS+菌株SDMCC050242及其突变株SDMCC050242ΔprtS发酵牛乳后胞外游离氨基酸含量,发现两菌株胞外游离氨基酸含量存在显著差异,尤其是野生株SDMCC050242胞外甲硫氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和GABA含量明显高于突变株,表明上述氨基酸对菌株的生长有重要作用。向培养基中外源添加上述差异氨基酸,发现只有甲硫氨酸能够恢复突变株SDMCC050242ΔprtS合成GABA的能力,由此证明甲硫氨酸是PrtS促进GABA合成的关键因子,而且甲硫氨酸的含量直接影响GABA的合成,通过上调codY基因的转录,从而发挥促进作用;同时,甲硫氨酸对GABA合成的促进作用普遍适用于PrtS-野生型嗜热链球菌。5嗜热链球菌中GABA合成响应酸胁迫的探究细胞壁蛋白酶PrtS能够促进嗜热链球菌生长和快速产酸。为了阐明GABA合成响应酸胁迫的生理机制,本文选择2株GABA产量不同的嗜热链球菌SDMCC050242和SDMCC050243,测定其生长和代谢的变化。结果表明,在指数生长期菌株的β-半乳糖苷酶基因lacZ和乳酸脱氢酶基因ldh的转录水平越高、对应酶的活性越强,其GABA产量越高。此外,启动子PgadB的强度随pH的降低而增加,说明菌株产酸促进了 gadB基因的表达,从而合成GABA。同时,较高的GABA产量提高了菌株在酸胁迫下的存活性,证实了 GABA合成对菌体细胞遭受酸胁迫时的保护作用。牛乳实验进一步证实了,嗜热链球菌通过合成GABA响应自身快速产酸造成的酸胁迫以保护菌体细胞,是菌株自身调节的适应机制。6鸟肠球菌中谷氨酸脱羧酶系统的遗传组成及功能分析鸟肠球菌是定植在人和其它动物肠道内的常见乳酸菌,常见于发酵海产品,能产生GABA赋予产品益生功能,但鸟肠球菌GAD系统的遗传组成及各组分的功能尚不清晰。本研究从粪便样品中分离到一株产GABA的鸟肠球菌SDMCC050406,通过序列测定,发现该菌株中含有由3个gadB基因（gadB1,gadB2和gadB3）、1个gadC基因和1个gadR基因共同组成的GAD系统。为了分析3个gadB基因在GABA合成中的作用,比较菌株SDMCC050406中上述3个基因的转录水平以及对应的酶活性,发现在正常生长情况下gadB3基因的转录水平显著高于gadB1和gadB2基因,而且gadB3基因编码的GAD3具有更高的酶活性和底物亲和力。进一步失活gadB3基因,发现突变株SDMCC050406ΔgadB3的GABA产量显著降低,并伴随着菌株抗酸胁迫能力的下降。上述结果表明gadB3基因在鸟肠球菌的GABA生物合成中发挥重要作用,丰富了乳酸菌GABA合成的遗传多样性。