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糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）是糖尿病最常见的并发症之一,约3/4的糖尿病患者死于DCM诱发的心血管事件。DCM发病隐匿,病程较长,预后差,其发病机制至今尚未完全阐明,其中慢性、低度的炎症反应可诱导心肌细胞炎性死亡-焦亡和纤维化。DCM中心肌细胞焦亡导致心脏收缩和舒张障碍,心肌纤维化使心脏变硬,顺应性降低,两者互相促进,导致心功能进行性受损,因此炎症反应被认为是DCM发生发展的关键病理生理学因素。进一步深入阐明DCM相关炎性机制,探索有效的干预措施刻不容缓。炎性细胞因子白介素33（Interleukin 33,IL-33）是2005年新近鉴定的IL-1家族细胞因子,其受体肿瘤发生抑制蛋白2（suppression of tumorigenicity 2,ST2）主要包括两种形式:可溶性ST2（soluble ST2,s ST2）和跨膜型ST2（transmembrane ST2,ST2L）。IL-33与细胞膜表面ST2L结合可引起胞内增殖、焦亡和炎症等多种信号通路改变,被称为IL-33/ST2L轴。研究报道,IL-33/ST2L轴通过改善压力负荷性心肌细胞肥大,减轻炎症反应,发挥心脏保护作用,且IL-33/ST2L轴敲除促进缺血再灌注诱导的心脏衰竭。尽管如此,仍有不少相反的发现,IL-33/ST2L轴在病毒性心肌损伤或心梗时上调,并通过诱导炎症反应,促进心肌细胞死亡和心脏纤维化,降低心功能。简单地认为IL-33/ST2L轴在心脏疾病中发挥保护作用或损伤作用可能过于片面,且其在DCM损伤中究竟发挥何种作用,亟待深入研究加以厘清。气体信使分子一氧化碳（carbon monoxide,CO）在多种疾病损伤尤其是心血管疾病中具有良好的保护效应,诱导内源性CO或使用良好拟合效应的外源性CO释放分子（Carbon monoxide releasing molecules,CORMs）可减轻高血压性心肌病、心脏移植和心梗等引起的心肌损伤,其机制与抑制细胞凋亡、焦亡或坏死,阻滞纤维化等有关。更为重要的是,近来有研究发现,诱导内源性CO可通过调节IL-33水平,减轻炎症反应,缓解脂多糖诱导的肺损伤,减轻类风湿关节炎纤维化等。那么,CO是否也能通过抗焦亡、抗纤维化在DCM中发挥保护作用?IL-33/ST2L轴在CO减轻DCM心肌损伤中有何作用?这些问题也需系统研究深入阐明。因此,本研究以野生型（WT）、IL-33-/-和ST2-/-的C57BL/6J小鼠建立DCM模型,并使用高糖处理HL-1心肌细胞和小鼠原代心肌成纤维细胞,应用CO释放分子2（CORM-2）分别在动物与细胞水平上进行干预,揭示DCM中IL-33/ST2L轴的作用及CORM-2的保护机制。具体而言,本研究包括以下三个部分:第一部分糖尿病心肌病与一氧化碳干预:IL-33/ST2L轴作用初探目的:给予WT、IL-33-/-和ST2-/-的DCM模型小鼠CORM-2干预,初步探讨IL-33/ST2L轴在DCM中的作用及CORM-2的干预效应。方法:7～8周龄雄性C57BL/6J小鼠给予正常饲料或高脂饲料（60%脂肪供能）喂养8个月,高脂喂养小鼠中期（4个月）连续腹腔注射链脲佐菌素（STZ,50 mg/kg·bw）,一周后空腹血糖（FPG）水平≥16.9 mmol/L的小鼠再腹腔注射CORM-2或失效的CORM-2（i CORM-2）进行干预。8个月后超声检测各组小鼠心功能,采血测定小鼠血清血糖和肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）水平。计算心脏胫骨长比,H＆E、Sirius Red染色和透射电镜观察心脏组织病理学改变,ELISA、免疫组化和Western blot检测IL-33和ST2水平,免疫荧光检测心肌组织心肌成纤维细胞与IL-33共定位。另取自发糖尿病动物ob/ob小鼠和ZDF大鼠,验证心肌组织中IL-33和ST2L蛋白表达。进一步利用IL-33-/-和ST2-/-小鼠依上述方法建立DCM模型并给予CORM-2干预,比较心脏组织病理学和心功能改变。结果:1.1与WT小鼠相比,DCM小鼠血糖和CK-MB水平升高（P<0.05）;心脏胫骨长比增加（P<0.05）;心肌组织结构排列紊乱,胶原蛋白沉积,线粒体结构疏松,肌丝断裂;心脏射血分数和短轴缩短率下降（P<0.05）。DCM小鼠经CORM-2干预后,尽管血糖和心脏胫骨长比无明显变化,但血清CK-MB、心脏组织病理学及心功能指标均有明显改善（P<0.05）。而i CORM-2干预对DCM小鼠无明显影响。1.2与WT小鼠相比,DCM小鼠血清中IL-33和s ST2水平分别增加21.9%和22.6%（P<0.05）,心肌组织中IL-33和ST2L蛋白表达分别增加118.2%和116.8%（P<0.05）;ob/ob小鼠和ZDF大鼠心肌组织IL-33和ST2L蛋白表达相比对照组也有明显升高（P<0.05）。DCM小鼠经CORM-2干预后,血清中IL-33和s ST2水平及心脏中IL-33和ST2L表达降低（P<0.05）。i CORM-2干预对DCM小鼠IL-33和ST2L表达无明显影响。1.3与DCM小鼠相比,IL-33-/-和ST2-/-的DCM(DCMIL-33-/-和DCMST2-/-)小鼠存活率降低,血清CK-MB水平升高（P<0.05）,心脏组织病理学及心功能指标均有明显降低（P<0.05）,但心脏胶原沉积却有明显缓解。1.4与DCM小鼠的干预明显不同,DCMIL-33-/-和DCMST2-/-小鼠经CORM-2干预后,小鼠血清CK-MB水平、心肌组织病理学和心功能指标无任何明显改善。小结:IL-33/ST2L轴上调直接影响DCM的发生发展,但其缺失也加重了DCM心肌损伤;一氧化碳干预可能通过维持IL-33/ST2L轴稳态,减轻DCM病变。第二部分IL-33/ST2L轴对糖尿病心肌病心肌细胞焦亡的调控及一氧化碳的干预目的:探讨IL-33/ST2L轴对DCM中心肌细胞焦亡的影响及CORM-2的干预效应方法:动物处理和分组同第一部分。Western blot检测心肌组织中焦亡相关蛋白表达水平。以高糖处理的HL-1心肌细胞为研究对象,乳酸脱氢酶（LDH）释放和CCK-8评估高糖培养的HL-1心肌细胞损伤情况,检测IL-33和ST2L蛋白表达;分别加入重组IL-33（r IL-33）、IL-33中和抗体（αIL-33）,改变IL-33水平,检测心肌细胞损伤及焦亡相关蛋白表达。进一步使用IL-33 si RNA降低IL-33,高糖处理后检测心肌细胞焦亡相关蛋白水平。使用CORM-2（100 n M）干预高糖处理的HL-1心肌细胞,检测细胞损伤情况及焦亡相关蛋白、IL-33和ST2L表达。结果:2.1与WT小鼠相比,DCM小鼠心肌组织焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD-N、cleaved caspase-1和cleaved IL-1β表达增加（P<0.05）。与DCM小鼠相比,DCMIL-33-/-和DCMST2-/-小鼠焦亡相关蛋白表达进一步增加（P<0.05）。2.2 DCM小鼠经CORM-2干预后,心肌组织焦亡相关蛋白表达降低（P<0.05）。与DCM小鼠的干预明显不同,DCMIL-33-/-和DCMST2-/-小鼠经CORM-2干预后,焦亡相关蛋白表达无明显改变。2.3与对照组（5.5 m M葡萄糖）HL-1细胞相比,高糖孵育HL-1细胞48 h（33m M葡萄糖,HG）LDH释放增加（P<0.05）,细胞活性降低（P<0.05）,同时,焦亡相关蛋白、IL-33和ST2L表达增加（P<0.05）,并随葡萄糖浓度升高而表达增加。2.4 HG孵育的HL-1细胞经r IL-33（1-10 ng/m L）处理48 h后,焦亡相关蛋白表达增加（P<0.05）。2.5使用αIL-33处理HG孵育的HL-1细胞48 h,1 ng/m LαIL-33处理对细胞损伤无明显影响;10 ng/m LαIL-33处理后,LDH释放减少（P<0.05）,细胞活性增加（P<0.05）,GSDMD-N和cleaved caspase-1蛋白表达降低（P<0.05）;100ng/m LαIL-33处理后,cleaved caspase-1表达增加（P<0.05）;1000 ng/m LαIL-33处理后,LDH释放增加（P<0.05）,细胞活性降低（P<0.05）,NLRP3、GSDMD-N和cleaved caspase-1表达增加（P<0.05）。2.6使用IL-33 si RNA处理HL-1细胞,然后加高糖处理,与HG组相比,IL-33干扰效率约为90%时,焦亡相关蛋白水平升高（P<0.05）,IL-33干扰效率约为70%时,焦亡相关蛋白水平无明显改变。2.7 HG孵育的HL-1细胞经CORM-2（100 n M）干预48 h后,GSDMD-N、cleaved IL-1β、IL-33和ST2L表达水平降低（P<0.05）,LDH释放减少（P<0.05）,细胞活性增加（P<0.05）。小结:IL-33/ST2L轴上调或缺失均可促进DCM心肌细胞焦亡;一氧化碳可能通过维持IL-33/ST2L轴稳态,减轻心肌细胞焦亡,缓解DCM病变。第三部分IL-33/ST2L轴对糖尿病心肌病心肌成纤维细胞活化的介导及一氧化碳的干预目的:探讨IL-33/ST2L轴对DCM中成纤维细胞活化的作用及CORM-2的干预效应。方法:动物处理和分组同第一部分。Western blot检测心肌组织纤维化相关蛋白的表达,免疫荧光检测心肌组织中IL-33和成纤维细胞共定位。以高糖孵育的WT小鼠心肌成纤维细胞为研究对象,α-SMA免疫荧光和Ed U染色评估高糖孵育的成纤维细胞活化程度;免疫荧光检测IL-33和ST2L表达;进一步加入r IL-33和αIL-33处理,α-SMA免疫荧光、Ed U染色、CollagenⅠ和CTGF m RNA评估成纤维细胞活化程度;高糖条件下,分别给予IL-33-/-和ST2-/-心肌成纤维细胞r IL-33处理,检测成纤维细胞活化程度;给予WT成纤维细胞CORM-2干预,检测成纤维细胞活化程度及CORM-2干预后IL-33和ST2L水平。结果:3.1与WT小鼠相比,DCM小鼠纤维化相关蛋白α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1和CTGF表达水平升高（P<0.05）。与DCM小鼠相比,DCMIL-33-/-小鼠CollagenⅠ和TGF-β1表达降低（P<0.05）,DCMST2-/-小鼠CollagenⅠ、TGF-β1和CTGF蛋白降低（P<0.05）。3.2 DCM小鼠经CORM-2干预后,纤维化相关蛋白水平降低（P<0.05）。而DCMIL-33-/-和DCMST2-/-小鼠经CORM-2干预后,纤维化相关蛋白水平无明显改变。3.3 WT成纤维细胞经高糖孵育（33 m M,HG）48 h后,α-SMA表达及Ed U阳性细胞增加（P<0.05）,同时IL-33和ST2L蛋白表达增加（P<0.05）。3.4 HG孵育的成纤维细胞经r IL-33（10 ng/m L）处理后,α-SMA表达、Ed U阳性细胞、CollagenⅠ和CTGF m RNA水平增加（P<0.05）;经αIL-33（1000 ng/m L）处理后,心肌成纤维细胞活化减轻（P<0.05）。另外,高糖处理条件下,与WT成纤维细胞相比,IL-33-/-和ST2-/-成纤维细胞活化程度降低（P<0.05）;IL-33-/-成纤维细胞经10 ng/m L r IL-33处理后活化程度增加（P<0.05）;但是,ST2-/-成纤维细胞经10 ng/m L r IL-33处理后无明显变化。3.5 HG孵育的成纤维细胞经CORM-2（30 n M）干预后活化程度减轻,同时IL-33和ST2L荧光表达水平降低（P<0.05）。小结:IL-33/ST2L轴直接诱导心肌成纤维细胞活化;一氧化碳通过抑制IL-33/ST2L轴,减轻心肌成纤维细胞活化,缓解DCM纤维化。结论:DCM病理条件下,IL-33/ST2L轴上调诱导心肌细胞焦亡,促进心肌成纤维细胞活化;IL-33/ST2L轴缺失同样促进心肌细胞焦亡,介导心功能障碍;一氧化碳通过维持IL-33/ST2L轴稳态,减轻心肌细胞焦亡,抑制心肌成纤维细胞活化,缓解DCM病变。