论文部分内容阅读
目的: 探讨鞘磷脂合酶1(sphingomyelin synthase1，SMS1)在氧化应激诱导的Neuro-2a细胞凋亡中的作用，与神经酰胺和ERK通路的关系，探讨SMS1可能的神经保护机制。 研究方法: 1.体外培养小鼠脑神经瘤细胞(N2a)细胞，用不同浓度梯度的过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)建立氧化应激模型，并用MTT法和光镜显微镜评价模型。用Real-time PCR和western blot检测不同浓度梯度H2O2处理的细胞中SMS1的基因和蛋白水平变化。 2.实验分为对照组、H2O2组、H2O2+D609组和D609组。对照组:用含1％小牛血清的高糖DMEM培养液孵育N2a细胞24h; H2O2组:用含150μM H2O2的培养液孵育N2a细胞24h; H2O2+D609组:用SMS1的抑制剂50μtM D609孵育N2a细胞3h后，加入终浓度为150μM的H2O2培养液孵育N2a细胞24h; D609组:先用抑制剂50μM D609孵育N2a细胞3h，然后改用含1％小牛血清的高糖DMEM培养液继续孵育N2a细胞24h。采用Real-Time PCR法从基因水平检测SMS1表达， Western-blot法从蛋白水平检测SMS1及磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)表达。质谱-液相色谱联用分析法检测神经酰胺水平。 Hoechst33342染色法和流式细胞仪测定各组细胞凋亡率。 结果: 1.H2O2刺激后细胞的形态发生变化，MTT显示:MTT的吸光度值随着H2O2浓度的梯度样升高而逐渐降低，表明H2O2降低了细胞活性。 2.H2O2组（50μM，100μM，150μM）呈浓度依赖性地上调SMS1的蛋白和基因水平的表达。 3.与正常N2a细胞对照组相比，H2O2（150μM）处理组显著上调细胞内SMS1的蛋白和基因表达水平(P＜0.01)，并明显增加p-ERK的蛋白表达水平(P＜0.01)。SMS1抑制剂D609预处理组可抑制H2O2处理后的SMS1表达上调，并降低p-ERK的蛋白表达水平（P＜0.01），单用D609组与对照组无明显差异(P＞0.05)。 4.与对照组相比，H2O2（150μM）处理组可升高细胞内神经酰胺水平(P＜0.05)，SMS1抑制剂D609预处理可使H2O2刺激导致的神经酰胺增多更加显著(P＜0.05)。 5.H2O2处理诱导了N2a细胞的凋亡，与对照组有明显差异（P＜0.05），抑制剂D609预处理组可加重H2O2诱导的细胞凋亡（P＜0.05）。 结论: 1.SMS1的表达水平受H2O2的调节。 2.SMS1在H2O2诱导的细胞凋亡中起保护作用，可能通过减轻神经酰胺对ERK的抑制作用达到保护细胞的目的。