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研究背景奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)作为第三代铂类化疗药物,对结直肠癌、胰腺癌、肺癌等多种实体肿瘤均有疗效。但应用奥沙利铂的患者85%～95%会出现相关的周围神经病变,临床表现主要为末梢感觉麻木、痛觉过敏或超敏、“套袜样”感觉异常。冷刺激可加重其神经症状,并且具有明显的剂量依赖性和时间依赖性,往往因严重的神经性病变造成奥沙利铂治疗的中断,影响患者的治疗效果,甚至缩短生存时间。因此,探究奥沙利铂诱导的周围神经病变的分子机制,对减轻或避免奥沙利铂治疗所产生的神经毒性作用具有重要的指导意义。有研究表明,奥沙利铂对周围神经的损伤比对中枢的损伤更为明显,因此探索背根神经节离子通道改变及受损的分子机制,是揭示周围神经损伤后兴奋性改变的基础。电压门控钾离子通道是参与神经元兴奋性改变的重要离子通道之一,通过维持静息膜电位和控制动作电位放电参与神经元兴奋性的调节。在奥沙利铂诱导的周围神经损伤动物模型中,电压门控钾离子通道1.2(Kv1.2)的蛋白表达减少,引起神经元兴奋性增加,然而对靶向kv1.2分子调控机制仍知之甚少。表观遗传学指基于非基因序列改变所致的基因表达水平的变化,可调控基因的表达,参与疼痛的调节。DNA甲基化是其中一种重要方式,主要由DNA甲基化转移酶(DNMTs)参与DNA甲基化和双加氧酶(TETs)参与DNA去甲基化进行调节,通过不同机制抑制基因转录。双加氧酶1(TET1)通过降低TETs家族蛋白表达,将5mC转化成5hmC,从而抑制DNA去甲基化,抑制基因的转录。我们预实验结果表明,在奥沙利铂诱导的神经痛模型中,背根神经节TET1表达减少,但是TET1是否靶向调控kv1.2的表达,参与奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛仍不清楚。因此,本研究建立奥沙利铂化疗痛模型,探究去甲基化转移酶TET1与Kv1.2分子靶向调控机制,为治疗奥沙利铂诱导的周围神经病变提供新思路和新方向。研究目的本研究探讨奥沙利铂引起的神经病理性疼痛中钾离子通道的变化,以及相关表观遗传学调控机制,为减轻奥沙利铂诱导的周围神经毒性提供理论依据。研究方法1.大鼠腹腔注射奥沙利铂(6mg/kg),每两天一次,共注射4次,建立化疗引起的周围神经病理性疼痛模型,应用von-Frey丝观察大鼠机械缩足阈值,冷板试验观察冷痛缩足潜伏时间,丙酮试验记录缩足评分;应用qPCR技术筛选8个不同亚型钾离子通道,检测建模后第14天DRG和大脑前扣带回基因表达水平。2.通过免疫荧光技术检测DRG神经元kv1.2与CGRP、IB4和NF200共标情况,以及建模后第7、14、21天DRG神经元kv1.2平均荧光强度。3.应用western-blot和qPCR技术检测建模后第7、14、21天DRG神经元kv1.2的基因和蛋白表达变化。4.应用免疫荧光技术检测DRG神经元TET1与CGRP、IB4和NF200共标情况,以及建模后第7、14、21天DRG神经元表达TET1阳性细胞率。5.应用western-blot和qPCR技术检测建模后第7、14、21天TET1的基因和蛋白表达变化。6.使用TET-loxp转基因小鼠,通过DRG显微注射cre重组酶,条件性敲除DRG神经元中TET1基因,观察行为学变化;应用qPCR技术检测TET1敲除后kv1.2基因表达变化。7.应用免疫荧光技术检测DRG神经元中TET1与kv1.2共定位情况,以及建模后第14天两者共标率。8.在大鼠建立化疗模型前,应用DRG显微注射技术给予过表达TET1慢病毒。SD大鼠分组:Naive,TET1-NC+OXA,TET1-Lv+OXA三组,观察大鼠行为学变化以及TET1和kv1.2蛋白表达水平;在大鼠建立化疗模型后,应用DRG显微注射技术给予过表达TET1慢病毒。SD大鼠分组:Naive,OXA+TET1-NC,OXA+TET1-Lv三组,观察大鼠行为学变化。9.在小鼠建立化疗模型前,应用DRG显微注射技术给予过表达TET1慢病毒。C57/BL 小鼠分组:Naive,TET1-NC+OXA,TET1-Lv+OXA 三组,观察小鼠机械痛行为学变化以及TET1和kv1.2基因表达水平。实验结果1.大鼠奥沙利铂化疗痛模型建立后,与Naive组相比,OXA组大鼠双侧机械痛阈和冷痛阈在建模后7～21天显著降低(P<0.001),表明模型建立成功。qPCR筛选结果显示,DRG 中 kv1.1(P<0.001)、kv1.2(P<0.01)、kv2.1(P<0.01)和kv3.4(P<0.05)的 mRNA 表达降低,大脑前扣带回中 kv3.4(P<0.05)、kv4.3(P<0.01)和kv7.5(P<0.01)的mRNA表达降低。而kv1.4和kv4.2的mRNA表达在这两个部位均不变。2.免疫荧光发现kv1.2主要表达在神经元胞浆和胞膜上,与大中小直径神经元以及肽能神经元共标,几乎不与卫星胶质细胞共标;并且建模后第7(P<0.001)、14(P<0.01)、21(P<0.01)天DRG神经元kv1.2阳性细胞平均荧光强度明显降低。3.Western blot结果显示,大鼠建模后第7、14、21天DRG神经元kv1.2蛋白表达均明显下调(P<0.05),qPCR显示建模后7(P<0.05)、14(P<0.05)、21(P<0.01)天DRG神经元kv1.2的mRNA表达也均降低。4.免疫荧光发现TET1主要表达在细胞核上,与大中小直径神经元和肽能神经元共标,大鼠建模后第7(P<0.001)、14(P<0.01)、21(P<0.01)天DRG神经元TET1阳性细胞平均荧光强度明显降低。5.Western blot和qPCR结果显示,大鼠建模后第14天TET1蛋白(P<0.001)和mRNA(P<0.01)表达均降低,但是DNMT3A两者均没有明显变化;大鼠建模后第7、14、21天DRG神经元TET1蛋白表达均明显降低(P<0.001),并且第7(P<0.05)、14(P<0.05)、21(P<0.01)天 DRG 神经元 TET1 的 mRNA 表达也均降低。6.在TET-loxp转基因小鼠中,发现DRG显微注射cre酶后第21天出现明显的机械痛敏(P<0.05),持续到28天(P<0.001);qPCR显示TET1和kv1.2的mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。7.免疫荧光双标发现kv1.2与TET1共标,大鼠建模后第14天两者共标率降低(P<0.05)。8.在大鼠建模前7天给予TET1-Lv/NC,与TET1-NC+OXA组相比,行为学显示,在建模后第7天TET1-Lv+OXA组机械痛阈值(P<0.05)和冷痛阈值(P<0.05)均明显缓解,并且持续到21天;Western blot显示,大鼠建模后第14天kv1.2和TET1的蛋白表达均被逆转(P<0.05)。在大鼠建模后第7天给予TET1-Lv/NC,与OXA+TET1-NC组相比,行为学显示,在建模后第14天OXA+TET1-Lv组机械痛阈值(P<0.05)和冷痛阈值(P<0.05)均明显缓解,并且持续到28天。9.建立小鼠奥沙利铂化疗痛模型,在建模前14天给予TET1-Lv/NC,结果显示,与TET1-NC+OXA组相比,建模后第14天缩足频率无论是0.07g还是0.4g均缓解(P<0.05),qPCR显示小鼠kv1.2的mRNA表达被逆转(P<0.05)。研究结论在奥沙利铂化疗痛模型中,背根神经节TET1通过下调kv1.2的基因和蛋白表达水平,参与奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛。