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研究目的:本文的一切努力都旨在寻找能解决虫草素在体内被腺苷脱氨酶（ADA）降解而失去其生物活性问题的途径。为此,我们首先对脂质体是否可以作为一种载体来保护虫草素免于被ADA降解进行了尝试并对如何获得高效装载的虫草素脂质体进行了探索;此外,对虫草素衍生物联合脂质体来保护其体内抗肿瘤活性的新思路也进行了初步的探讨。总体设计研究方法:本研究的设计思路如下:1,首先对虫草素的提取分离方法进行了验证;2,以肝癌H22荷瘤小鼠和肝癌Bel-7402细胞为体内外模型验证硫酸铵梯度法制备虫草素脂质体的体内外抗肿瘤活性;3,研究可以高效装载虫草素的技术,并对获得相应脂质体的抗肿瘤活性进行验证;4,以优化的pH梯度法为基础,以上述体内模型对制备的虫草素衍生物脂质体进行体内抗肿瘤活性验证。1,虫草素的提取分离将蛹虫草菌种进行斜面接种活化后进行一级液体发酵培养和二级液体发酵培养,二级发酵培养15天后,收集培养液离心后取上清液,浓缩后用无水乙醇沉淀,离心去除沉淀后收集上清液,浓缩至小体积后使用阳离子交换树脂富集,多次重结晶后制得虫草素。2,硫酸铵梯度法制备虫草素脂质体采用硫酸铵梯度法制备虫草素脂质体后,对其包封率、体外渗漏、体外抗肿瘤活性（对Bel-7402细胞的细胞毒作用、细胞凋亡、细胞周期阻滞作用）与体内抗肿瘤活性（对H22荷瘤小鼠的肿瘤与免疫器官的影响）进行验证。3,高效装载虫草素脂质体的制备以制备方法（逆向蒸发法、pH梯度法、硫酸铵梯度法、乙醇注入法、薄膜分散法、逆向蒸发法-pH梯度法、逆向蒸发法-微囊化法（the microencapsulation vesicle method（MCV））-pH梯度法）和卵磷脂（蛋黄卵磷脂（EPC）、氢化大豆卵磷脂（HSPC）、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG））为变量,以虫草素脂质体的包封率为响应量,对虫草素脂质体的制备技术进行筛选;以逆向蒸发法-pH梯度法和逆向蒸发法-微囊化法-pH梯度法分别制备以HSPC和DSPG为卵磷脂的四种脂质体,记为脂质体1-4。对具有不同结构的脂质体1和脂质体3的体外抗肿瘤活性进行验证（对Bel-7402细胞的细胞毒作用、细胞凋亡、细胞周期阻滞作用）;对四种脂质体的粒径、Zeta电位、体内抗肿瘤活性（一）（对H22荷瘤小鼠的肿瘤与免疫器官的影响）进行验证;再对脂质体3的体内抗肿瘤活性（二）（对H22荷瘤小鼠的肿瘤与免疫器官的影响）进行验证;将等体积的氯仿变为1:1（v/v）的氯仿/乙醚,采用逆向蒸发法-pH梯度法制备HSPC脂质体和PEG2000-DSPE修饰脂质体,对其体内抗肿瘤活性（三）（对H22荷瘤小鼠的肿瘤与免疫器官的影响）进行验证。4,虫草素酰胺衍生物脂质体的制备以pH梯度法为制备方法,观察不同比例的蛋黄卵磷脂/氢化大豆卵磷脂（6:0、5:1、3:3、1:5、0:6,m/m）对虫草素脂质体包封率的影响;以A:卵磷脂/胆固醇（m/m）,B:孵育温度（℃）,C:药脂比（m/m）为三因素进行L9（34）表正交实验设计,以包封率和载药量为指标筛选最优制备方案;以最优方案制备虫草素普通脂质体、负电荷脂质体与长循环脂质体,对它们的细胞（以Bel-7402细胞为模型）毒作用进行研究;对虫草素酰胺衍生物与硼酸衍生物脂质体的包封率及体内活性（对H22荷瘤小鼠的肿瘤与免疫器官的影响）进行验证。结果1,虫草素的提取分离所制备的虫草素样品外为白色晶体;薄层色谱结果表明其与虫草素标准品的Rf值相近;高效液相结果表明它的纯度可达98%。2,硫酸铵梯度法制备虫草素脂质体所制备的虫草素脂质体的包封率为42.5%;体外渗漏实验表明:在0-40天内,虫草素脂质体会有一个快速的泄漏;而在40天后,仅仅有少量的渗漏被观察到;体外抗肿瘤活性实验表明虫草素脂质体能够降低虫草素对Bel-7402细胞的效力、能够诱导细胞发生凋亡作用、可以改变虫草素的细胞周期阻滞从G0/G1期到G2/M期;体内抗肿瘤活性实验表明虫草素脂质体H22瘤有良好的抑制作用,且对H22小鼠的免疫器官没有表现出不良副作用（脾指数与胸腺指数与对照组相比没有显著性的增加）。3,高效装载虫草素脂质体的制备采用EPC为膜材时,五种常见的虫草素脂质体制备方法所制备的虫草素脂质体的包封率结果从大到小为:逆向蒸发法>pH梯度法>硫酸铵梯度法>乙醇注入法>薄膜分散法;以HSPC为膜材时,逆向蒸发法和pH梯度法所制备的虫草素脂质体的包封率都显著性高于EPC为磷脂所制备的脂质体;以逆向蒸发法联合pH梯度法联合所制备的虫草素脂质体的包封率显著性高于单一制备方法所得的脂质体;以逆向蒸发法-微囊化法-pH梯度法联合所制备的虫草素脂质体的包封率显著性高于逆向蒸发法-pH梯度法联用所制备的脂质体;此外,在HSPC中加入一定比例带负电荷的二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）也可促进虫草素的包封;体外活性实验表明:对Bel-7402细胞的细胞毒作用从大到小依次为虫草素>脂质体3>脂质体1,诱导细胞凋亡的能力从大到小依次为脂质体1>脂质体3>虫草素,脂质体1与脂质体3均能改变虫草素的细胞周期阻滞从G0/G1期到G2/M期;脂质体2与脂质体4的粒径与Zeta电位无显著性差异,脂质体1与脂质体3的粒径与Zeta电位无显著性差异,脂质体2与脂质体4的粒径显著性低于脂质体1与脂质体3,脂质体2与脂质体4的Zeta电位绝对值显著性高于脂质体1与脂质体3。体内活性（一）表明:脂质体1-4与对照组相比均没有表现出显著性的抑瘤活性,小鼠的脾指数均有显著性的增高,胸腺指数没有显著性的变化;体内活性（二）表明:脂质体3低剂量组与对照组相比表现出显著性的抑瘤活性,高、低剂量组小鼠的脾指数均有显著性的增高,胸腺指数没有显著性的变化;体内活性（三）表明:PEG修饰HSPC组与对照组相比表现出显著性的抑瘤活性而HSPC组没有,两组的脾指数均有显著性的增高,胸腺指数没有显著性的变化。4,虫草素酰胺衍生物脂质体的制备HSPC的引入对于虫草素脂质体的包封有一个促进作用,考虑到经济因素,PL-100M/HSPC=5:1的比例将被用于下述实验;综合包封率和载药量因素,方案1将被用于下述实验;体外细胞毒实验表明:在不同的时限下,虫草素普通脂质体、负电荷脂质体与长循环脂质体的细胞毒作用间无显著性差异,与虫草素组相比有显著性的增加;虫草素正丁酰氯衍生物脂质体的包封率为56.2±2.3%,虫草素4’羧基苯硼酸衍生物脂质体的包封率为51.4±1.4%;HSPC脂质体组、PEG修饰脂质体组、虫草素正丁酰氯衍生物脂质体组和虫草素4’-羧基苯硼酸衍生物脂质体组与对照组相比均没有表现出显著性的抑瘤率,但PEG修饰脂质体组的瘤重最小,且四种脂质体组的脾指数与胸腺指数与对照组相比均无显著性的增加。结论及意义本实验所建立的虫草素的分离提纯方案可行性较高;脂质体可作为一种载体保护虫草素的体内抗肿瘤活性,PEG修饰的虫草素脂质体或许具有更大的治疗效应,同时也为虫草素其它活性的临床研发提供了可借鉴的思路;虫草素衍生物与纳米载体（如脂质体）的联合应用或许是一条值得被重视的发展途径。本研究所做的一切工作对于促进虫草素的临床应用奠定了坚实的实验室基础,同时为水溶性弱碱性药物的脂质体高效装载提供了一条可以借鉴的思路。