菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australis R.Br.或菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟种子,始载于《神农本草经》,性味甘温,归肝、肾、脾经,具有补肾益精、养肝明目、止泻安胎之功效,是中医补肾、壮阳、固精之要药,因其具有良好的生物和药理活性,被广泛用于药品、保健品和化妆品领域。菟丝子药用历史悠久,且炮制历史悠久,古代常用的炮制方法有酒制法、盐制法、炒制、米泔制等。《中国药典》（2015年版和2010年版）收载的菟丝子炮制品规格为盐炙菟丝子。清代《得配本草》中记载“补肾气,淡盐水拌炒”,将炮制与临床应用相结合,指出菟丝子盐炙后可以改变药性,入肾经,补肾气。在中医理论中,认为菟丝子的补肾固精作用与免疫系统的增强密切相关,因此菟丝子补肾固精的药效除了对肾脏和生殖系统有保护作用外,对免疫系统也起到调节作用。近年研究表明,菟丝子中的黄酮类和多糖类成分具有很好的生物活性,是其发挥临床作用的主要有效成分,具有提高免疫力、保护生殖系统、抗氧化、抗衰老、抗病毒等作用。本课题是国家自然基金项目《南方菟丝子盐炙增强补肾固精的药效物质基础及炮制原理研究》中的一部分。本实验意在比较研究菟丝子生品、盐炙品的黄酮类和多糖类成分的差异以及其对免疫系统调节作用的异同,从物质基础和药效的角度分析菟丝子盐炙前后的变化。本实验还对菟丝子盐炙中的两个主要因素食盐和加热分别与免疫调节作用的相关性以及对黄酮、多糖组分的影响进行了研究,以阐明菟丝子盐炙中的关键影响因素。目的:1.测定菟丝子生品和盐炙品中总黄酮、总多糖以及单体黄酮的含量,分析其炮制前后黄酮类和多糖类成分的变化,阐明菟丝子盐炙前后物质基础的变化规律。2.研究比较菟丝子生品和盐炙品多糖的单糖组成,初步揭示其盐炙前后多糖组分的变化。3.研究比较菟丝子生品、盐炙品的总黄酮和总多糖对肾阳虚大鼠免疫作用的影响,探讨其免疫调节作用机制和物质基础。4.研究菟丝子盐炙中辅料食盐和加热两个因素分别与肾阳虚大鼠免疫作用的相关性以及对黄酮类和多糖类成分的影响,结合化学成分和药效的相关分析,探讨盐炙中的主要炮制因素。方法:1.收集河北、黑龙江、内蒙古和四川4产地的菟丝子,按标准分别炮制其盐炙品、水炙品、水炙外加食盐品以及盐水拌品,并制备河北产地菟丝子生品和各炮制品的黄酮提取物和多糖提取物。2.采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠分光光度法,以金丝桃苷为对照品,测定总黄酮含量,比较菟丝子生品和各炮制品总黄酮含量的差异。3.采用苯酚-硫酸分光光度法,以甘露糖为对照品,测定总多糖含量,比较菟丝子生品和各炮制品总多糖含量的差异。4.采用HPLC法测定金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山奈酚以及异鼠李素5种单体黄酮的含量,比较菟丝子生品和各炮制品单体黄酮的差异。色谱柱:Agilent TC C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）;检测波长:360 nm;柱温:45℃;流速:1mL/min;进样体积:15 μL;0.4%磷酸为水相（B）、甲醇为有机相（A）,梯度洗脱。5.采用多糖PMP柱前衍生化、HPLC检测方法检测菟丝子生品、盐炙品粗多糖和精制多糖中的单糖组成。色谱柱:Agilent TC C18（4.6 mm×250mm,5 μm）;检测波长:250nm;流速:1 mL/min;进样量:20 μL;0.1 mol/L磷酸盐缓冲液为流动相B;乙腈为流动相A,等度洗脱。6.菟丝子生品、盐炙品的黄酮和多糖提取物灌胃肾阳虚大鼠,30天后进行大鼠脏器系数、巨噬细胞吞噬能力、白细胞数目、T淋巴细胞、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的检测。7.菟丝子生品、盐炙品、水炙品、水炙外加食盐样品以及盐水拌样品的提取物灌胃肾阳虚大鼠,30天后进行大鼠脏器系数、T淋巴细胞、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的检测。结果:1.通过检测可知,河北、黑龙江、内蒙古、四川4产地菟丝子中的总黄酮含量依次为1.98%、1.65%、1.56%、0.87%。其中,河北产地菟丝子中的总黄酮含量较高。2.测定结果显示,4产地菟丝子生品和各炮制品中总黄酮含量的变化趋势一致,以河北为例,生品（1.98%）、盐炙品（2.07%）、水炙品（2.05%）、水炙外加食盐（2.06%）、盐水拌（1.99%）。3.通过检测可知,河北、黑龙江、内蒙古、四川4产地菟丝子中的总多糖含量依次为6.32%、9.80%、8.72%、8.67%。其中,黑龙江产地菟丝子中的总多糖含量较高。4.测定结果显示,4产地菟丝子生品和各炮制品中总多糖含量的变化趋势一致,以河北为例,生品（6.32%）、盐炙品（8.56%）、水炙品（7.91%）、水炙外加食盐（7.79%）、盐水拌（6.08%）。5.通过检测可知,河北、黑龙江、内蒙古、四川4产地菟丝子中5种单体黄酮的含量存在一定的差异,四川菟丝子中的单体黄酮含量较低,其余3产地菟丝子中的含量基本一致。以河北为例,其金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的含量依次为 0.28%、0.16%、0.009%、0.092%、0.006%。6.测定结果显示,4产地菟丝子各炮制品中单体黄酮含量的变化趋势基本一致,以河北为例,金丝桃苷:生品（0.28%）、盐炙品（0.27%）、水炙品（0.28%）、水炙外加食盐（0.27%）、盐水拌（0.28%）;紫云英苷:生品（0.16%）、盐炙品（0.13%）、水炙品（0.13%）、水炙外加食盐（0.13%）、盐水拌（0.16%）;槲皮素:生品（0.009%）、盐炙品（0.016%）、水炙品（0.017%）、水炙外加食盐（0.016%）、盐水拌（0.007%）;山奈酚:生品（0.092%）、盐炙品（0.069%）、水炙品（0.078%）、水炙外加食盐（0.076%）、盐水拌（0.090%）;异鼠李素:生品（0.006%）、盐炙品（0.005%）、水炙品（0.005%）、水炙外加食盐（0.005%）、盐水拌（0.005%）。7.本实验测定了河北产地菟丝子生品、盐炙品粗多糖和精制多糖的单糖组成,其主要单糖均为甘露糖,还有葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖等。以菟丝子生品的粗多糖为例,以甘露糖作参照,其甘露糖:葡萄糖:鼠李糖:半乳糖:半乳糖醛酸:木糖:阿拉伯糖为 1:0.144:0.053:0.628:0.096:0.017:0.072。8.菟丝子生品和盐炙品对肾阳虚大鼠免疫作用的比较研究:检测结果显示,和正常对照组比较,模型组指标均具有显著性差异,说明肾阳虚大鼠模型成功;与模型组比较,菟丝子生品的黄酮组和多糖组以及盐炙品的黄酮组和多糖组的各项指标均具有显著性差异。9.菟丝子盐炙中炮制因素的研究:检测结果显示,和正常对照组比较,模型组指标均具有显著性差异,说明肾阳虚大鼠模型成功;与模型组比较,菟丝子盐炙品和水炙品的各项指标均具有显著性差异,即盐炙品和水炙品的免疫调节作用较好。结论:1.菟丝子盐炙后,其总黄酮和总多糖含量都明显增高,可能是因为炮制过程是一个加热过程,提高了种子的脆碎度,提高了黄酮和多糖的溶出率,因此其盐炙后的总黄酮和总多糖含量增加。2.菟丝子盐炙后,其单体黄酮槲皮素的含量明显增高,金丝桃苷、紫云英苷和山奈酚的含量降低,异鼠李素含量变化不明显。其原因可能是因为菟丝子炮制后存在其他苷类成分水解转化为槲皮素,而紫云英苷和山奈酚则在炮制的过程中水解破坏。3.PMP柱前衍生化结合HPLC法可用于测定菟丝子多糖的单糖组成,测定结果表明菟丝子盐炙以及精制前后多糖的单糖组成均无明显变化,主要单糖均为甘露糖。4.菟丝子生品、盐炙品的黄酮提取物和多糖提取物对肾阳虚大鼠均具有较好的免疫调节作用。其中菟丝子盐炙品的免疫调节作用较生品的稍好,总多糖的免疫调节作用较总黄酮的稍好。菟丝子盐炙后的免疫调节作用增强,可能与盐炙后总黄酮、总多糖和槲皮素含量的升高有关。5.菟丝子炮制后,其总黄酮、总多糖以及单体黄酮含量均发生明显变化。菟丝子盐炙品、水炙品以及水炙外加食盐样品中的总黄酮、总多糖和槲皮素含量均明显升高,金丝桃苷、紫云英苷和山奈酚含量降低,而盐水拌样品中的总黄酮、总多糖和单体黄酮含量则变化不明显,表明菟丝子经过加热处理后,提高了黄酮和多糖的溶出率,说明菟丝子盐炙中的加热因素是影响其总黄酮、总多糖和单体黄酮含量变化的主要因素。6.菟丝子生品和各炮制品对肾阳虚大鼠均具有一定的免疫调节作用,但其盐炙品和水炙品提取物的免疫调节作用比水炙外加食盐和盐水拌样品提取物的免疫调节作用稍强,表明菟丝子盐炙中的加热因素是影响其免疫调节作用的主要因素,食盐的加入方式对其免疫调节作用也有一定的影响。