乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharide,EPS）在食品医药等领域具有广泛的应用前景。但由于乳酸菌胞外多糖的产量普遍较低不利于进行工业化生产,提高乳酸菌胞外多糖产量逐渐成为国内外食品科学领域的研究热点。为了提高乳酸菌胞外多糖的产量,人们筛选高产乳酸菌胞外多糖的菌株、优化菌株的培养条件、改善胞外多糖提取条件以及利用现代生物技术手段研究乳酸菌产糖机制。本实验室前期从西藏地区开菲尔粒中分离得到一株具有高产乳酸菌胞外多糖特性的马乳酒样乳杆菌ZW3（Lb.Kefiranofaciens ZW3）。胞外多糖产量最高可达2080.53 mg/L。随后,实验室获得一株野生型ZW3的2#突变株,且2#的生长速度和胞外多糖产量均有明显下降。经基因组重测序发现2#突变株中有6个相关催化反应酶类基因发生了突变,分别为 WANG-0173、WANG-0174、WANG-0175、WANG-0292、WANG-0840和WANG-1108。用RT-qPCR技术观察不同时间下6个基因的相对表达量,并且对其中两个基因WANG-0840和WANG-1108进行了分子机制的研究。由于基因WANG-0292发生了同义突变,因此本实验只对剩余基因WANG-01 73、WANG-0174和WANG-0175进行进一步的研究。二羟丙酮激酶作为糖代谢中的相关催化反应酶,与胞外多糖合成的反应息息相关。因此本实验选择的研究对象是ZW3中共同编码二羟丙酮激酶的基因dhaKLM（即基因WANG-0173、WANG-0174和WANG-0175）。经生物信息学分析了解到基因WANG-0173、WANG-0174和WANG-0175分别编码二羟丙酮激酶的亚基DhaK、DhaL和DhaM。这三个亚基共同构成PEP依赖型-二羟丙酮激酶（DhaKLM）。实验先构建了含有pET30a-dhaKLM-ZW3/2#重组质粒的E.coli BL21表达菌株,成功诱导表达了蛋白。制备二羟丙酮激酶的粗酶液,并对ZW3和2#中二羟丙酮激酶的相对酶活进行测定,发现2#中发生突变的二羟丙酮激酶的活性比ZW3低,证明突变对二羟丙酮激酶蛋白活性造成了影响。然后又构建了含有pMG36e-dhaKLM重组质粒的乳酸乳球菌NZ9000,SDS-PAGE结果表明,基因在NZ9000中实现了表达。测定二羟丙酮激酶对NZ9000生长及产糖的影响,发现含有重组质粒的NZ9000菌株生长速率低于野生菌株;在一定条件下乳酸菌NZ9000胞外多糖产量有所升高,证明二羟丙酮激酶过表达确实会促进乳酸乳球菌NZ9000产胞外多糖。本研究将马乳酒样乳杆菌ZW3中的二羟丙酮激酶在大肠杆菌和乳酸乳球菌中进行表达和研究,证明该酶在乳酸乳球菌NZ9000中的过表达促进了胞外多糖的合成。初步证实了二羟丙酮激酶是马乳酒样乳杆菌ZW3高产胞外多糖性能的原因之一,为利用基因工程手段培育高产胞外多糖的乳酸菌奠定了理论基础。