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肝脏表达抗菌肽1(liver-expressed antimicrobial peptide1, LEAP-1)、肝脏表达抗菌肽2(LEAP-2)和p防御素(β-defensin)是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,广泛存在于鱼类中,是鱼类先天免疫系统的重要成分,在抵御病原微生物入侵的过程中发挥着重要作用。LEAP-1在体内外具有抑制细菌、真菌、病毒和原生动物生长的作用,在机体铁平衡的调控方面也发挥着重要作用。LEAP-2作为另外一种重要的抗菌肽,具有抗菌作用。β-defensin除了能直接杀死细菌和病毒外,还可以间接促进效应细胞的补充,诱导多种细胞因子和趋化因子的表达,促进伤口愈合和血管生成。团头鲂是我国重要的淡水经济养殖鱼类。为了阐明LEAP-1、LEAP-2和β-defensin在团头鲂早期发育阶段以及细菌免疫应答中的作用,为后续研究3种抗菌肽在其先天免疫系统中的生物活性奠定理论基础,本研究通过分子克隆技术获得团头鲂LEAP-1、LEAP-2基因全长cDNA序列以及β-defensin基因部分cDNA序列,构建3种基因的时空表达谱,并对免疫注射细菌后3种抗菌肽基因在团头鲂组织中的表达变化进行了研究。主要研究结果如下：1.团头鲂LEAP-1和LEAP-2基因分子克隆与表达分析团头鲂LEAP-1基因cDNA (GeneBank accession no. JQ308841)全长779bp,其中开放阅读框285bp,5’端非编码区115bp,3’端非编码区379bp。开放阅读框编码94个氨基酸的前体肽,包括24个氨基酸的信号肽,45个氨基酸的前结构域和25个氨基酸的成熟肽。对团头鲂LEAP-1氨基酸序列进行同源性比较,结果表明团头鲂LEAP-1氨基酸序列与草鱼、鳙的相似性最高,达到95%。实时定量PCR分析表明,在胚胎发育阶段,LEAP-1基因mRNA表达量在囊胚中期下降,在眼囊出现期显著增加到最大值,在尾鳍出现期迅速下降到中等水平。出膜后,LEAP-1基因mRNA表达量在出膜后第1和3d逐渐增加到中等水平,在出膜后第7d降到低水平。在团头鲂成鱼组织中,LEAP-1基因mRNA在肝脏中表达量最高。细菌免疫后,团头鲂肝脏中LEAP-1基因mRNA表达量逐渐增加并在注射后144h达到最高(P>0.05)。脑组织中表达量在注射后72h达到最大(P>0.05)。在脾脏和鳃中表达量分别在注射后24h、6h显著上升(P<0.05)。团头鲂LEAP-2基因cDNA (GeneBank accession no. JQ344324)全长564bp,其中开放阅读框279bp,5’端非编码区35bp,3’端非编码区250bp。开放阅读框编码92个氨基酸的前体肽,包括26个氨基酸的信号肽,25个氨基酸的前结构域和41个氨基酸的成熟肽。对团头鲂LEAP-2氨基酸序列进行同源性比较,结果表明团头鲂LEAP-2氨基酸序列与草鱼、斑马鱼的相似性最高,分别达到95%、84%。实时定量PCR分析表明,在胚胎发育阶段,LEAP-2基因mRNA表达水平在原肠胚中期显著增加到最大值,随后急剧下降到较低水平并保持到心跳期。在出膜前期表达量显著增加并在刚出膜阶段达到第二个峰值。出膜后,LEAP-2基因mRNA表达量在出膜后第3d显著下降到较低水平,并上下波动一直持续到出膜后第31d。在成鱼组织中,LEAP-2基因mRNA在中肠表达量最高。注射细菌后,肝脏中LEAP-2基因mRNA表达水平在注射后72h和144.h显著上调(P<0.05)。在脾脏、脑和鳃中,LEAP-2基因mRNA表达量分别在注射后6h、24h和6h出现显著上调(P<0.05)。2.团头鲂β-defensinl和β-defensin2基因分子克隆与表达分析团头鲂β-defensin1、β-defensin2基因(maBD-1, maBD-2)部分cDNA序列分别长201bp和207bp。maBD-1、maBD-2的登录号分别为KC351182和KC412160。对团头鲂maBD-1、maBD-2前体肽氨基酸序列进行同源性比较,结果表明maBD-1氨基酸序列与鲤、斑马鱼的相似性最高,分别达到98%、97%。maBD-2氨基酸序列与鲤、斑马鱼相似性最高,分别达到90%、87%。实时定量PCR结果表明,在胚胎发育阶段,maBD-1基因mRNA表达量在心脏出现期之前保持较低水平,在心跳期增加到中等水平。出膜后,maBD-1基因mRNA表达量在出膜后第1d显著增加到最高值,在出膜第3d后下降到中等表达水平,并进一步降到较低水平。maBD-2基因mRNA表达量在受精卵中最高,随后下降到较低水平一直持续到出膜后第31d(除肌肉效应期)。实时定量PCR结果显示,在成鱼组织中,maBD-1基因mRNA在皮肤中表达量最高；肝脏中maBD-2基因mRNA表达量高于肾脏、脑和前肠(P>0.05),但是表达量都非常低。注射温和气单胞菌后,maBD-1在团头鲂肝脏和皮肤中表达量显著上调,而maBD-2在肝脏、皮肤、鳃和前肠中表达量显著升高。