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当细胞处于应激状态和细胞内压力增大时,会激活细胞自噬功能。自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。细胞应激时,巨自噬、微自噬启动快但功能持续时间较短(<10 h),而CMA启动较晚,但持续时间长,三种自噬互相影响并互为补充。细胞CMA的活性主要取决于溶酶体膜上LAMP-2A(Lysosomal-associated membrane protein 2A)的量,LAMP-2A量的减少会引起细胞CMA功能减退,呈现“功能性衰老细胞”的现象,这些细胞在多种应激因素的作用下,容易导致细胞内错误蛋白质聚集、代谢紊乱等,细胞最终进入凋亡途径。绝大多数细胞内都会维持基本的CMA活性,在应对细胞损伤,维持胞内蛋白质质量等方面发挥重要作用。我们的实验结果也显示,小鼠的脑、卵巢、睾丸、肝脏、脾脏、肾脏、肺组织中,都能检测出LAMP-2和LC3蛋白,说明上述组织中均具有一定的CMA和巨/微自噬活性;与报道的结果一致。然而,我们对小鼠睾丸组织进行免疫组化和免疫荧光研究时发现,LAMP-2在间质细胞和支持细胞内大量表达,在精原细胞中有表达;但在精母细胞、长形精子细胞、圆形精子细胞中不表达,说明精母细胞等不具有CMA活性。与之关联的是:小鼠睾丸热激或实验性隐睾时,支持细胞、间质细胞、精原细胞与精母细胞、圆形精子细胞、长形精子细胞在几乎相同的温度环境中却分别产生了存活和凋亡两者截然不同的结果,提示支持细胞等其他细胞具有的CMA功能可能在抵御应激对细胞的不利影响、避免细胞进入调亡途径方面具有重要的作用。对此,我们利用CMA功能减低的TM4细胞(小鼠睾丸支持细胞系)为材料,研究在CMA功能减低的情况下,支持细胞对热激等应激条件的反应,探讨CMA功能在支持细胞中的作用,以及支持细胞CMA功能的缺失是否产生与精母细胞类似的细胞学表现,从自噬角度揭示支持细胞抵御热激的原理。主要研究结果显示:1.利用茴香霉素抑制TM4细胞的CMA,当茴香霉素浓度大于0.04 后,与未热激组相比,热激组细胞的存活率显著降低。初步说明CMA功能的缺失降低了 TM4细胞对热激的抵抗力。2.用慢病毒侵染敲低Lamp-2基因表达降低TM4细胞CMA活性后,在正常培养情况下,短时间内对巨/微自噬活性代偿性增加的影响有限,但在细胞处于应激条件下,CMA的抑制会导致巨/微自噬活性代偿性大幅度增加,特别是像热激这样的高强度应激,细胞做出的自噬反应也更强;说明支持细胞与其他体细胞相似,细胞内存在完整的自噬保护系统,巨自噬/微自噬和CMA存在互补和代偿性保护作用。3.茴香霉素抑制CMA功能或敲低LAMP-2降低CMA活性后,细胞在热激处理后生长状态变差。同时,随着热激后时间的延长,细胞凋亡率愈来愈高。说明,CMA活性的维持和增加,对支持细胞抵御热激的损伤、避免细胞进入凋亡途径等具有重要的积极作用。4.CMA活性降低后,饥饿和热激等应激因素的作用下,细胞增殖活跃程度均下降。提示:CMA活性的降低,不仅增加了细胞在应激条件下的凋亡程度,同时还降低了细胞的增殖能力。根据以上结果我们初步分析,敲低LAMP-2、茴香霉素处理抑制CMA功能的TM4细胞,与Lamp-2基因敲除的肝细胞、因不表达LAMP-2和HSC-70t(Heat shock cognate protein70t)等失去了 CMA活性的精母细胞一样,成为一种“功能性衰老细胞”,因CMA功能降低或丧失而对热激等应激因素的抵抗力减退,最终启动凋亡途径。