血红素(heme)是生物体内一种重要的分子,参与组成血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素P450、维生素B1等。血红素的合成由8步酶催化的级联反应组成,相应的催化酶分别由对应的基因编码,包括ALAS1和ALAS2、ALAD、HMBS、UROS、UROD、CPOX、PPOX、FECH。血红素合成过程中的酶的功能的缺陷导致一系列被称为卟啉症(porphyria)的综合症。卟啉症的临床症状复杂,目前的诊断和治疗手段相对有限。斑马鱼作为一种模式生物,在人类疾病的研究中有着广泛的应用,其相应基因缺陷的突变体能够作为人类卟啉症的疾病模型。已有报道斑马鱼alas2,urod,ppox,fech基因缺陷的突变体能够分别作为人类先天性铁粒幼细胞性贫血症(CSA)、肝性红细胞生成性卟啉症(HEP)、杂色卟啉症(VP)、细胞生成性原卟啉症(EPP)的疾病模型,但其他几种卟啉症还没有可稳定遗传的斑马鱼疾病模型。本文运用TALEN技术建立了斑马鱼alad基因缺陷的突变体,作为人类5-氨基酮戊酸脱水酶缺乏性卟啉症(ALA dehydratase deficient porphyria,ADP)的疾病模型。还运用CRISPR-Cas9技术建立了斑马鱼cpox基因缺陷的突变体,作为人类遗传性粪卟啉症(Hereditary coproporphyria,HCP)的疾病模型。对两种突变体的表型分析显示,与野生型相比,alad-/-和cpox-/-突变体的血红素合成受阻,体内血红素含量显著减少,血细胞发育异常,血红蛋白含量显著下降,中间产物异常累积,同时血红素合成通路中的相关基因表达水平异常。此外,人ALAD m RNA和CPOX m RNA分别能够解救斑马鱼alad-/-和cpox-/-的表型,说明alad和cpox的功能在人和斑马鱼中具有保守性。斑马鱼中存在两个编码血红素合成第三步反应酶的基因,分别为hmbsa和hmbsb。系统树分析表明这两个基因为复制基因,是人HMBS基因的共同直系同源基因(co-orthologs)。本文运用CRISPR-Cas9和TALEN技术建立了斑马鱼hmbsa和hmbsb基因缺陷的突变体,作为人类急性间歇性卟啉症(Acute intermittent porphyria,AIP)的疾病模型,并对其表型进行了分析。两种纯合突变体均显示血红素缺失的贫血症状,并且突变体表型的显著程度随等位基因的缺失程度而增加。同时与野生型相比,两种突变体幼鱼和成鱼的行为均显示异常。为了对卟啉症的病理机制做出更详细的解析,本文还对两种已有报道的斑马鱼卟啉症及贫血模型urod-/-和alas2-/-进行了高通量深度测序转录组分析,结果显示血红素的缺失导致大量基因的表达发生了改变。不同发育阶段和不同突变体中的差异表达基因也不尽相同,显示了卟啉症的复杂性。血红素合成的限速酶基因alas1的表达受生物钟系统调控,生物钟系统通过血红素偶联能量代谢途径。为了深入探究生物钟系统与血红素合成的相互作用关系,本文还运用CRISPR-Cas9技术建立了斑马鱼per1a基因的突变体以及per基因全部敲除的突变体。并证实了alas1的表达节律在per1a突变体中发生了改变。本文首次运用反向遗传学技术建立了四种人类卟啉症的斑马鱼疾病模型,分别模拟人ADP,HCP和AIP,为相应疾病的病理机制研究提供了重要的动物模型,并为治疗卟啉症的药物筛选工作提供了有力的工具。本文还建立了生物钟突变体,为研究斑马鱼生物钟系统与血红素代谢间的相互作用关系提供了独特的方向。