论文部分内容阅读
大规模的研究统计表明,约半数以上的结直肠癌患者在原发灶确诊或术后会发生肝转移,而肝转移是影响结直肠癌患者预后的主要因素,因此,结直肠癌肝转移诊断和预测一直是结直肠癌领域研究的重点。近年来,非编码RNA在肿瘤中的研究越来越受到重视,并取得了一定成果,但大部分研究仍集中于小RNA(如miRNA),却忽视了另外一类数量更多且序列更长的非编码RNA,即长链非编码RNA (IncRNA)。有研究初步显示IncRNA具有多种分子生物学功能,广泛参与细胞生长与发育的调控。针对IncRNA参与肿瘤转移调控的研究尚处于起步阶段,而从IncRNA角度探索结直肠癌肝转移(Colorectal liver metastasis,CLM)相关性的研究则报道甚少。鉴于此,本研究课题拟分四个部分初步探讨IncRNA在CLM中的作用及可能的机制：首先利用高通量IncRNA芯片技术在有/无肝转移的结直肠癌组织及正常肠组织进行IncRNA表达谱的系统筛查,再通过逐步扩大临床样本验证,确定可能与CLM相关的目标IncRNA。在此基础上,针对目标IncRNA结合临床资料分析,并进行体外细胞功能实验和裸鼠模型体内实验,从而判定目标IncRNA对肠癌细胞增殖和肝转移的影响。最后,通过对转移相关信号通路的筛查与验证,初步探讨目标IncRNA对结直肠癌肝转移的调控机制。第一部分结直肠癌肝转移相关IncRNA的筛选、验证及临床意义目的：寻找可能与CLM密切相关的目标IncRNA,并研究其与患者临床病理特征及生存预后的关系。方法：利用IncRNA芯片分别在无肝转移、异时性肝转移、同时性肝转移的肠癌组织及正常肠黏膜组织上进行筛查。结合生物信息学分析,逐步扩大临床样本进行定量PCR验证,以明确可能与CLM相关的目标IncRNA。收集CLM患者临床病理特征与生存随访资料,分析目标IncRNA的临床意义。结果：LncRNA芯片筛查发现1332个CLM差异表达IncRNA,从中选择40个可能与CLM相关的IncRNA。经扩大临床病例样本验证,最终确定3个在CLM中差异表达显著且目前尚未报道的目标IncRNA,并命名为IncRNA-CLMAT1-3。结合临床资料分析,其中IncRNA-CLMAT1高表达与肠癌患者发生肝转移及淋巴结转移显著相关(P<0.05)；且CLMAT1低表达组患者的中位生存时间明显长于高表达组患者(33.7个月 vs.30.1个月,P=0.04)。结论：LncRNA在不同肝转移的肠癌组织中呈差异表达,其中IncRNA-CLMAT1可能与结直肠癌肝转移的发生有关,其高表达与预后不佳相关。第二部分IncRNA-CLMAT1对人肠癌细胞体外增殖、迁徙及侵袭能力的影响目的：研究IncRNA-CLMAT1对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁徙、侵袭等生物学功能的影响。方法：定量PCR检测IncRNA-CLMAT1在不同肠癌细胞系的表达差异。构建CLMAT1干扰与过表达质粒并慢病毒包装,转染肠癌细胞系以获得CLMAT1高表达与低表达肠癌细胞。显著下调或上调CLMAT1表达水平后,用CCK8法、流式细胞技术、划痕实验及transwell等方法观察该IncRNA对结直肠癌细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁徙、侵袭等生物学功能的影响。结果：LncRNA-CLMAT1在LOVO细胞中相对高表达,而在HCT116细胞相对低表达。用CLMAT1干扰与过表达慢病毒颗粒分别转染LOVO细胞与HCT116细胞,均达到下调与上调CLMAT1表达水平的目的。CCK8实验及细胞周期流式实验发现CLMAT1不能显著改变肠癌细胞的增殖曲线,也不能显著影响细胞合成期所占的比例或增殖指数。细胞凋亡分析发现CLMAT1可显著降低肠癌细胞的总凋亡率。划痕和transwell实验均发现CLMAT1能显著促进结直肠癌细胞的迁徙及侵袭能力。结论：LncRNA-CLMAT1不能显著影响肠癌细胞的增殖能力,但能明显抑制肠癌细胞发生凋亡,并显著促进肠癌细胞的迁徙及侵袭能力。第三部分IncRNA-CLMAT1对荷瘤裸鼠肿瘤生长及肝转移的影响目的：利用裸鼠皮下移植瘤模型及CLM模型,进一步研究IncRNA-CLMAT1对肠癌增殖、转移能力的影响。方法：利用嘌呤霉素筛选法获得稳定转染CLMAT1过表达(实验组)或空载体(对照组)慢病毒颗粒的HCT116细胞,通过裸鼠皮下接种及脾包膜下接种含HCT116细胞悬液(2×106/只)分别构建皮下移植瘤模型与CLM模型,并采用活体荧光成像系统动态观察裸鼠体内肝转移瘤的发生发展。皮下瘤模型主要观察瘤体生长趋势、肿瘤体积及肿瘤重量的差异；CLM模型观察肝转移瘤的大小及数目等。结果：在裸鼠皮下成瘤模型中,实验组裸鼠在成瘤时间、生长曲线及肿瘤重量等较对照组裸鼠均无显著差异。在裸鼠CLM模型中,实验组裸鼠肝转移瘤数目或大小与对照组裸鼠比较更为明显,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：通过人肠癌细胞裸鼠移植瘤模型及CLM模型,体内实验进一步证实IncRNA-CLMAT1不能明显影响肠癌细胞的增殖能力,但能促进肠癌肝转移的发生。第四部分IncRNA-CLMAT1促进肠癌转移机制的初步研究目的：探讨IncRNA-CLMAT1促进结直肠癌侵袭转移的可能机制及潜在的靶基因。方法：通过上皮-间质转化转化(Epithelium-Mesenchyme transition,EMT)相关PCR芯片筛查、定量PCR、蛋白印迹(Western-Blot, WB)、细胞免疫荧光和免疫组化等实验方法,探索CLMAT1对EMT相关标志物及转录因子的影响；在干扰转录因子SNAIL表达前提下,通过WB.transwell等方法等探索CLMAT1促进肠癌细胞发生EMT及对肠癌细胞侵袭能力的影响。结果：CLMAT1可诱导肠癌细胞发生EMT样的形态学改变；在转录水平和蛋白水平,CLMAT1均明显促进上皮标志物E-cad表达下调,而间质标志物N-cad、VIM表达上调。CLMAT1并可促进转录因子SNAIL、MMP3、SLUG表达,其中SNAIL差异表达存在显著性(P<0.05)；干扰SNAIL表达后,CLMAT1下调肠癌细胞E-cad表达水平及促进肠癌细胞发生侵袭的能力均受到明显减弱。结论：LncRNA-CLMAT1可通过调控转录因子SNAIL介导肠癌细胞发生EMT,从而促进肠癌发生转移。