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目的:利用目前高效快捷的CRISPR技术对体外培养的人原代淋巴细胞进行PD-1和CTLA-4基因双敲除方法:一.通过针对CTLA-4基因和PD-1基因各设计了三组候选sgRNA序列,并据此构建CRISPR-CTLA-4和CRISPR-PD-1敲除质粒。使用293淋巴细胞系验证了各个sgRNA的编辑效率。将对CTLA-4和PD-1基因编辑最高的两个sgRNA构建CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒。二.使用电穿孔的方法,尝试将CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒转染到人原代淋巴细胞中。为了达到电穿孔转染原代淋巴细胞的标准,对电穿孔的各种条件进行了摸索与优化。三.利用PCR扩增的方法,从CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒中扩增达到CTLA-4-PD-1片段,将此片段连接到腺病毒表达载体上,以尝试通过构建CRISPR-CTLA-4-PD-1腺病毒感染人原代淋巴细胞。四.利用构建靶向CTLA-4和PD-1基因的CRISPR/RNP蛋白复合物,使用已经优化好的电穿孔条件将其电穿孔转染到人原代淋巴细胞中,并观测转染后基因编辑的情况和改造后淋巴细胞对K562细胞系的杀伤效果。结果:成功构建CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒,并且验证了其在293细胞中能正常发挥基因编辑作用。对原代淋巴细胞电穿孔条件的建立,且对电转各个因素进行较为全面的分析,发现了不同的电压、脉冲时间、电转缓冲液、细胞培养状态,质粒大小与纯度对转染效率和细胞活率都有显著影响。其中,阳性GFP质粒电穿孔转染人原代淋巴细胞转染效率为34.5%。在目前来说,我们超越了多数实验室对人原代淋巴细胞的转染效率。成功构建了带有CRISPR-CTLA-4-PD-1系统的腺病毒表达载体。利用阳性腺病毒GFP感染人原代淋巴细胞感染效率达到了29.6%。成功制备了CRISPR/RNP蛋白复合物并将其转染到淋巴细胞中,实现了淋巴细胞的CTLA-4和PD-1基因编辑,改造后的淋巴细胞对K562细胞系具有更强的杀伤能力。结论:构建CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒并且对电穿孔转染人原代淋巴细胞的条件进行了全面的分析优化,实现了目前多数实验室难以达到的转染效率,为攻克原代淋巴细胞电穿孔技术难题提供了重要的借鉴意义,同时也的构建了带有CRISPR系统的腺病毒相关质粒,为后续的腺病毒感染人原代淋巴细胞实现基因双敲除奠定了基础。最后,利用电穿孔转染CRISPR/RNP蛋白复合物对原代淋巴细胞CTLA-4和PD-1基因进行有效编辑,并且提高其杀伤肿瘤细胞的能力,从而为肿瘤免疫治疗提供新思路,具有重要意义。