【摘 要】
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木聚糖酶在造纸、饲料、能源等领域有广泛应用。本实验室从黑曲霉中筛选到GH11家族β-1,4-内切木聚糖酶XynШ(X),其稳定性较低,难以应用于工业生产。实验室将海栖热袍菌GH10
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木聚糖酶在造纸、饲料、能源等领域有广泛应用。本实验室从黑曲霉中筛选到GH11家族β-1,4-内切木聚糖酶XynШ(X),其稳定性较低,难以应用于工业生产。实验室将海栖热袍菌GH10家族木聚糖酶Xyn A的碳水化合物结合结构域(CBM)融合到X的C端,将CBM拆分为CBM1(C1)和CBM2(C2),分别融合到X的N端和C端,显示C1提升X催化能力,C2显著提高X催化能力和稳定性。然而,目前CBM融合研究集中在单端。本课题将C1和C2通过linker融合到X两端,构建C1-X-C1、C1-X-C2、C2-X-C1和C2-X-C2四种融合酶,期待两端C1、C2相互协作提升酶的性质,论文结果如下:1)重组质粒的构建:利用反向PCR构建了重组质粒p ET20b-C2-X-C1和p ET20b-C1-X-C2。通过优化反向PCR,使用两步退火并调整Ramp值为0.2℃/s构建了带有重复序列的重组质粒p ET20b-C2-X-C2和p ET20b-C1-X-C1。转化BL21(DE3)细胞后,筛选转化子,经DNA测序显示序列正确,而后以IPTG诱导表达后,测定了C2-X-C2和C2-X-C1纯酶的酶学性质。2)酶学性质:融合酶C2-X-C2和C2-X-C1的最适p H(p Hopt)都为4.2,野生型酶X的p Hopt为3.8。C2-X-C2和C2-X-C1的最适温度都为45℃,两酶酶活在35℃-50℃之间能保持80%以上的酶活,有更广泛的温度适性。3)稳定性:在50℃保温下,C2-X-C1的t1/2为4.27 h,是X(21.04 min)的12倍,X-C2(69.3 min)的3.7倍,而C2-X-C2的t1/2为9.4 h,比X提高了26.8倍,是X-C2的8倍。在80℃保温下C2-X-C2的t1/2为2.8 h。4)动力学分析:山毛榉木聚糖底物时,C2-X-C1的Km值为3.97,C2-X-C2为1.44,X的Km值为2.72,C2-X-C2对山毛榉底物更高亲和力。C2-X-C1的Kcat值是183.39 s-1,C2-X-C2的Kcat值为445.15 s-1,大约是X(280.79)的1.6倍。燕麦木聚糖底物时,C2-X-C1与C2-X-C2的Km值分别为18.52、13.13与X(19.8)相比,亲和力有显著提升。C2-X-C1和C2-X-C2的Kcat值分别为150.62 s-1、774.86 s-1,C2-X-C2催化活力约是X(150)的5倍。木聚糖酶两端同时融合C1、C2结构域,能大幅提升酶的稳定性以对不溶性底物催化能力,证明了双端融合蛋白能实现功能的叠加,使酶的能力进一步的增强,也为酶分子的改造提供了新的思路。
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