杭白菊病毒病原鉴定及脱毒苗生物学性状与品质性状分析

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杭白菊(Chrysanthemun morifolium Ramat.)是浙江省桐乡市的主要特产,是浙江省八大名药材“浙八味”之一,近年来由于病毒病爆发严重影响了杭白菊的产量和品质,为此本文着重展开了分离和鉴定危害桐乡市杭白菊的主要病毒病原,创制了杭白菊脱毒健康种苗,并分析了脱毒对杭白菊生物学性状及品质性状的影响。主要研究结果如下:(1)调研了主产区桐乡市杭白菊专业合作社,发现几个重要种植基地病毒感染严重,病株的主要症状为叶片斑纹明显,花叶,分枝少,严重地块叶片呈褐色斑枯,植株枯死,致使菊花产量下降、品质变劣。(2)综合运用病毒粒子形态、DAS-ELISA检测、RT-PCR检测及序列测定等技术进行病原菌鉴定,透射电镜下观察到病株汁液含600~700nm略微弯曲的杆状病毒粒子;应用菊花B病毒(CVB)抗体进行DAS-ELISA检测结果为阳性,对阳性结果进行分子水平检测发现CVB外壳蛋白编码序列长度为982bp,测序结果在NCBI中进行BLAST比对,发现与报道的编码菊花B病毒外壳蛋白的核苷酸序列(GenBank登录号:EU499736.1)相似度最高为92%,可确定扩增片段为菊花B病毒的外壳蛋白基因,明确了侵染浙江省桐乡杭白菊的病毒病原为CVB。(3)采用“多步分步法”创制脱毒种苗,建立了杭白菊脱毒健康种苗的快速繁殖体系,外植体最佳的消毒处理为75%乙醇30s,0.1%氯化汞12mnin,成活率为70%;最适宜茎段生长壮苗的培养基为MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,最佳生根培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA,生根率为100%;待植株株高为5~6cm,根数为3-5条,根长约1cm时移栽到温室内生长,成活率可达100%。在解剖镜下剥取0.3~0.5mm无菌苗茎尖,接种到培养基中进行茎尖苗的诱导,茎尖成活率约10%,经透射电镜RT-PCR及DAS-ELISA等方法检测,获得12%脱除CVB的杭白菊苗。经田间的推广示范发现脱毒种苗在分枝数、有效花朵数、叶绿素相对含量参数方面与常规杭白菊有显著性差异,脱毒‘早小洋菊’的亩产量达490.1kg,脱毒‘小洋菊’的亩产量达1083.3kg,分别增产11%、29%。脱毒‘早小洋菊’、脱毒’小洋菊’中总黄酮的含量分别为70.41ng/g,63.94mg/g,常规苗中含量分别为53.44mg/g,43.41mg/g;脱毒‘早小洋菊’、脱毒‘小洋菊’中绿原酸含量分别为2.71mg/g、2.13mg/g,常规苗中含量分别为1.62mg/g,1.01mg/g,脱毒苗中绿原酸含量高于药典中规定的0.2%。
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