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嗜热不放氧光合细菌Chloroflexus aurantiacus是最早发现的绿色丝状非硫细菌,之所以能够进行光合作用,是因为它有一种光合生物中最大的捕光天线结构——绿小体,这也是它与绿硫细菌最大的共性。绿小体外形呈卵圆形,由单层膜包被,内部是皱褶管状结构,这些管状结构由细菌叶绿素c/d/e聚集形成的。绿小体能捕获光能并将激发能转移到光合反应中心,从而完成能量的传递和转换过程。绿小体被膜上存在一些色素蛋白复合物,其中蛋白CsmA、CsmM、CsmN含量最为丰富,另外通过基因组测序得知还有CsmP、CsmO、CsmY等几种蛋白。这些色素蛋白复合物在绿小体的光能传递过程中的作用方式和机理尚待阐明。本研究将集中关注CsmP等蛋白。本课题主要采用分子生物学和蛋白质化学的方法对几种绿小体被膜蛋白展开研究:(1)根据 NCBI 中已知的 Cfx.aurantiacus 的 csmM、csmN、csmP、csmO基因序列设计特异性引物与连接引物,以Cfx.aurantiacus基因组为模板,一方面用特异性引物进行单个基因的PCR扩增,再将PCR产物连接到克隆与表达载体pEASY-BluntE1 中得到 EAS1-BluncsmM、pEASY-Blunt E1-csmN.pEASY-Blunt El-csmP重组质粒;另一方面先用特异性引物与连接引物进行单个基因的PCR扩增,然后再将单个基因克隆在一起,最后连接至表达载体pEASY-BluntE1或pEASY-E2中,得到pEASY-E2-csmM-N-P-O、pESY-BluntE1-csmN-P-O、pEASY BluntEl-csmN-P、pEASY-BluntE1-csmP-O重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达;(2)对目标蛋白进行生物信息学分析,并根据分析结果对其进行诱导表达;(3)主要针对CsmP蛋白与CsmN-P融合蛋白,选择合适的条件进行IPTG诱导表达,再选择合适的纯化条件对目标蛋白采用亲和层析、离子交换和凝胶过滤等方法进行分离和纯化。(4)用气相扩散悬滴法对纯化得到的CsmP蛋白与CsmN-P融合蛋白进行三维晶体的结晶。本课题将为Cfx.aurantiacus绿小体结构与功能的进一步研究奠定物质基础。