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研究目的基于中国食管癌高发区人群,描述其口腔、食管、贲门部位菌群基本特征和构成特点,对比不同食管、贲门疾病状态人群口腔部位菌群构成差异,并筛选差异性菌群,探索上消化道微生态变化与食管癌、贲门癌及其癌前病变的关联,为我国食管癌和贲门癌的病因学探索提供微生物组学方向的新思路。材料与方法1.中国食管癌高发区食管癌及贲门癌患者菌群特征研究:以河南林州食管癌医院确诊的 67 例食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和 36例贲门癌（Gastric Cardia Adenocarcinoma,GCA）患者为研究对象,采集其术后癌组织及周围配对的癌旁组织标本,基于Illumina MiniSeq平台,运用16S核糖体RNA（16S rRNA）测序技术和 QIIME1（Quantitative Insights into Microbial Ecology）软件对标本进行测序和生物信息学分析,描述组织微生物特征,包括α多样性、β多样性和门、纲、目、科、属各个分类水平菌群相对丰度的构成。α多样性主要包括观测特征数（Observedspecies）和香农指数（Shannonindex）,β多样性包括加权和非加权的Unifrac距离矩阵。采用Wilcoxon秩和检验比较不同部位及肿瘤状态之间的α多样性差异。采用主坐标分析（Principal Coordinates Analysis,PCoA）和置换多元方差分析（Permutational Multivariate Analysis of Variance,PERMANOVA）检验不同部位和肿瘤状态之间的菌群特征构成差异。采用线性判别效应量分析（Linear discriminant analysis Effect Size,LEfSe）方法筛选与肿瘤状态或部位相关的差异性菌群。2.中国食管癌高发区食管及贲门疾病患者口腔菌群特征研究:以河南林州筛查队列人群中60例正常人、97例食管癌癌前病变患者和98例贲门癌癌前病变患者以及河南林州食管癌医院确诊的1 10例ESCC和GCA患者为研究对象,采集其口腔唾液、舌部拭子和牙菌斑标本,运用16S rRNA测序技术和QIIME2软件对标本进行测序和生物信息学分析。采用PCoA和PERMANOVA方法描述和比较正常人、食管鳞状上皮轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生、ESCC、贲门肠上皮化生（Intestinal Metaplasia,IM）、低级别上皮内瘤变（Low-grade Intraepithelial Neoplasia,LGIN）、高级别上皮内瘤变（High-grade IntraepithelialNeoplasia,HGIN）和GCA患者口腔不同部位的菌群特征。α多样性包括观测特征数、香农指数和Faith系统发育多样性（Faith’sphylogenetic diversity,Faith’s PD）,β多样性包括 Bray-Curtis距离矩阵、加权和非加权的Unifrac距离矩阵。运用多元Logistic回归模型和随机森林方法探索口腔菌群与ESCC、GCA及其癌前病变的关联。3.中国食管癌高发区人群口腔菌群特征动态变化的纵向研究:以36例河南林州筛查队列人群为研究对象,对其进行内镜筛查并收集其口腔唾液标本,间隔一年后对其进行二次内镜随访及口腔唾液标本采集,运用16S rRNA测序技术和QIIME2软件对标本进行测序和生物信息学分析,采用Wilcoxon符号秩和检验描述和对比其口腔唾液菌群特征随时间动态变化的规律。研究结果1.ESCC和GCA患者的平均年龄分别为62.2岁（标准差为6.8）和62.1岁（标准差为6.6）。GCA组织香农指数（4.3 vs 2.0;P<0.001）和观测特征数（102.5 vs 58.0;P=0.001）均显著高于癌旁组织。对于β多样性,基于加权Unifrac距离矩阵的分析显示ESCC组织和癌旁组织菌群构成呈现显著差异（P=0.015）,基于加权和非加权Unifrac距离矩阵结果均显示,GCA组织和癌旁组织菌群构成存在差异（P=0.004,P=0.002）。ESCC组织中梭杆菌属（Fusobacterium）的相对丰度高于癌旁组织,且这种趋势在门、纲、目、科各分类水平上也呈现一致性（门水平:3.9%vs 1.7%;属水平:3.2%vs 1.3%）。GCA组织与癌旁组织相比,普氏菌属（Prevotella,23.3%vs 13.7%）、链球菌属（Streptococcus,11.2%vs 4.2%）、韦荣球菌属（Veillonella,8.6%vs3.7%）、嗜血杆菌属（Haemophilus,4.3%vs 1.0%）和奈瑟球菌属（Ne isseria,4.8%vs 1.5%）的相对丰度高于癌旁组织,而螺杆菌属（Hellicobacter,11.8%vs 60.5%）相对丰度低于癌旁组织。2.梭杆菌属（Fusobacterium）相对丰度与ESCC肿瘤分级之间存在正相关关系,即随着ESCC肿瘤级别的升高,其癌组织中梭杆菌属（Fusobacterium）的相对丰度也随之增加（P=0.290）。对于GCA,普氏菌属（Prevotella）的相对丰度随肿瘤级别的升高而增加（P=0.080）,螺杆菌属（Helicobacter）的相对丰度随肿瘤级别的升高而降低（P=0.500）。3.ESCC癌旁组织α多样性显著高于GCA癌旁组织,其香农指数分别为3.8和2.0（P<0.001）,观测特征数分别为87.0和58.0（P=0.001）。ESCC组织和GCA组织之间的α多样性无统计学差异,基于加权和非加权的Unifrac距离矩阵的主坐标分析表明,ESCC组织和GCA组织菌群构成相似（P=0.017,P=0.004）,但ESCC癌旁组织和GCA癌旁组织菌群构成存在差异（两种距离矩阵均为P=0.001）。4.口腔牙菌斑的香农指数高于唾液和舌部（P<0.00I）,但唾液菌群的观测特征数最高（P<0.001）。对于β多样性,基于Bray-Curtis距离矩阵和Unifrac距离矩阵的分析均表明口腔牙菌斑的菌群构成与唾液及舌部具有显著差异,约15.0%的菌群构成变异来源于不同的口腔部位。5.在校正了年龄、性别、吸烟情况、饮酒情况、受教育程度、BMI（Body Mass Index）、水果摄入量以及口腔卫生情况后,结果显示食管鳞状上皮重度不典型增生患者口腔唾液多样性低于正常人（Faith’s PD,P-0.030）;贲门肠上皮化生、贲门低级别上皮内瘤变和GCA患者口腔唾液菌群的α多样性均高于正常人（观测特征数P均小于0.050）,而贲门高级别上皮内瘤变患者口腔唾液菌群α多样性低于正常人（Faith’s PD,P=0.060）。6.多元Logistic回归模型分析显示,在校正了年龄、性别、吸烟情况、饮酒情况、受教育程度、水果摄入量和口腔卫生情况后,口腔唾液罗氏菌属（Rothia）的相对丰度与ESCC癌前病变呈正相关。以正常人为对照组,食管轻度和重度不典型增生患者的OR值分别为1.25和1.80（P=0.002,P<0.001）。随机森林分析显示,唾液罗氏菌属（Rothia）对于区分正常人和食管鳞癌癌前病变患者具有较高的贡献度。口腔唾液二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）和韦荣球菌属（Veillonella）的相对丰度每增加1%,患ESCC的风险分别为原来的1.67倍和1.30倍（P均小于0.001）。对于贲门疾病,在校正了年龄、性别、吸烟情况、饮酒情况和水果摄入情况后,多元Logistic回归模型分析显示,口腔唾液罗氏菌属（Rothia）的相对丰度与贲门肠上皮化生的发生呈正相关（OR=1.30,P<0.001）。7.对比一年前后的两次口腔菌群特征发现,个体的唾液菌群多样性和菌属相对丰度构成发生变化,且变异程度各异,但总体上无统计学差异（P均大于0.050）。普氏菌属（Prevotella）在食管疾病好转者唾液菌群中含量升高,而在食管疾病恶化患者中含量降低;口腔唾液奈瑟菌属（Neisseria）、卟啉单胞菌（Porphynomonas）和罗氏菌属（Rothia）含量在食管疾病恶化患者中呈现上升趋势。结论1.与癌旁组织相比,ESCC组织中梭杆菌属（Fusobacterium）相对丰度较高,GCA组织中螺杆菌属（Helicobacter）相对丰度显著降低。食管和贲门部位的癌旁组织菌群特征显著不同,但在癌组织中两部位的菌群特征趋于相似。未来还需要更多的病例对照研究以及大规模的前瞻性队列研究来验证特定菌属和ESCC及GCA之间的关系。2.食管癌高发区人群口腔不同部位菌群构成不同,严重食管或贲门疾病患者的唾液菌群构成与轻度食管或贲门疾病患者之间存在显著差异。口腔唾液罗氏菌属（Rothia）相对丰度较高者患食管和贲门癌前病变的风险均增加,唾液二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）和韦荣球菌属（Veillonella）含量增加者患ESCC的风险增加。特定的微生物菌群具有作为上消化道肿瘤早期诊断的潜在价值。3.食管癌高发区人群口腔唾液菌群多样性及构成在一年内整体水平上无显著变化,但个体水平上变化较大。未来在开展探索口腔菌群与食管疾病关联的大规模前瞻性研究的同时,应注重口腔菌群随时间动态变化的规律。