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乳腺炎是乳腺遭受物理、化学或生物学刺激后机体与环境、病原微生物相互作用而引起的乳腺炎症反应,是奶牛最常见的疾病之一。据统计,我国奶牛乳腺炎的发病率介于30%-60%,个别高发区域则高达85%,每年造成的经济损失高达130多亿元。抗生素一直是治疗奶牛乳腺炎的首选方法,但随着抗生素泛滥使用造成耐药菌株的出现,严重威胁到动物性食品与公共卫生安全,以中药为代表的天然药物便逐渐被重视。连翘是传统中药,具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等功效。连翘酯苷A(FSA)作为其主要药效成分,具有杀菌、抗炎和抗氧化等多种生物学活性。本试验根据中医对乳腺炎的辩证分析,选用连翘及其主要成分连翘酯苷A作为研究药物,以LPS所诱导的BALB/c小鼠乳腺炎为动物模型,以NF-κB、MAPK炎症信号通路为主要对象,探究连翘及其主要活性成分的抗炎活性,以及其在调控乳腺炎性应答中的作用机制。本试验共分为三部分:试验一:连翘提取物的抗炎活性研究采用二甲苯致小鼠耳肿胀和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性试验探究连翘提取物的抗炎效果。设置连翘醇提物高(1.6 g/kg)、中(0.8 g/kg)、低(0.4 g/kg)三个剂量组,以紫花地丁、蒲公英、地塞米松为药物对照,另设炎症模型组和空白对照组。各组灌服给药后,分别计算和检测二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制率和醋酸致小鼠毛细血管通透性渗出染料的OD值,统计分析各试验药物组的抗炎效果。结果显示,连翘生药浓度在0.8 g/kg时,所产生的抗炎效果最佳。试验二:连翘不同极性段提取物抗炎活性比较为筛选连翘中的抗炎活性成分,对连翘进行不同极性段提取,并对分段提取物进行抗炎活性比较。首先将连翘药材水煎蒸馏提取挥发油后,将水相提取液滤过回收备用,药渣加入75%乙醇进行热回流提取,提取液过滤,合并两次滤液与上述水提取液得到连翘全成分提取液。随后将提取液减压浓缩后先加入等体积乙酸乙酯萃取,将萃取液减压浓缩干燥,得连翘乙酸乙酯提取物。经乙酸乙酯萃取后的药液再加入等体积的水饱和正丁醇,萃取减压浓缩得正丁醇提取物。剩余水层溶液,减压浓缩得连翘水相提取物。通过二甲苯致小鼠耳肿胀试验和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性试验,来观察连翘不同极性段提取物的抗炎活性。结果显示,在二甲苯致小鼠耳肿胀和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性试验中,连翘乙酸乙酯和正丁醇段的萃取物各剂量(低剂量0.4 g/kg,中剂量0.8g/kg,高剂量1.6 g/kg)均与模型组差异显著(P<0.05),抗炎活性显著;连翘挥发油在中剂量0.8 g/kg与高剂量1.6 g/kg时抗炎活性显著(P<0.05);水提物虽有一定的抗炎活性但与模型组比较并不显著(P>0.05)。综合分析,连翘正丁醇段提取物的抗炎活性最高。试验三:连翘酯苷A对小鼠乳腺炎症模型NF-κB和p38 MAPK信号通路的影响为研究连翘酯苷A对小鼠乳腺炎症模型NF-κB和p38 MAPK信号通路的影响。通过向产后雌性小鼠乳导管注射10 mg/kg的LPS来建立小鼠乳腺炎模型。分别设置连翘酯苷A低剂量(40 mg/kg)、中剂量(80 mg/kg)、高剂量组(160 mg/kg)、空白对照组和LPS模型对照组,连续灌胃给药1周。最后一次给药后,对连翘酯苷A各剂量试验组和模型对照组小鼠的第四对乳房注射LPS以诱导小鼠的乳房炎症,空白组注射同量生理盐水。致炎后6h、12h、24h和48h收集乳房组织,采用q PCR方法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、p38 MAPK、IκBα、p65 NF-κB的m RNA表达水平;病理切片HE染色观察乳腺组织的病理变化;用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子的含量;利用WB蛋白质印迹分析乳腺组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK、p65 NF-κB、p-p65 NF-κB、IκBα的蛋白表达及磷酸化水平。结果表明,LPS模型组IL-1β、IL-6、TNF-α、p38MAPK、IκBα和p65 NF-κB的表达与空白对照组相比均上调,切片观察到明显的炎症反应。连翘酯苷A干预后,与LPS模型组相比,q PCR方法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、p38 MAPK、p65 NF-κB的m RNA表达水平显著减低,IκBα作为NF-κB通路的抑制因子则显著增高;通过切片观察,乳腺组织的病理变化也明显减轻,乳腺组织趋于正常;ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子的含量与模型组相比也显著降低;WB蛋白质印迹分析结果显示经连翘酯苷A干预后的乳腺组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK、p65NF-κB、p-p65 NF-κB的蛋白表达及磷酸化水平与模型组相比均显著降低;作为NF-κB通路的抑制因子的IκBα,在不同剂量的连翘酯苷A作用后也与LPS组有显著差异。综合结果表明,连翘酯苷A可以通过调节p65 NF-κB和p38 MAPK信号通路有效抑制LPS所诱导的小鼠乳腺炎症,中剂量连翘酯苷A组(80 mg/kg)的抗炎活性最为显著。