世界卫生组织2016年的报告指出全世界有4.22亿人患有糖尿病,且主要分布于发展中国家。近三十年,中国的糖尿病患病率增加了17%。如果不实施任何干预措施,中国将成为糖尿病患者数量最高的国家。糖尿病患者并发心血管疾病的风险将显著增加,而80%糖尿病患者死于心血管相关类疾病。I型和II型糖尿病可直接影响心脏的结构和功能,这一病理改变独立于冠心病和高血压因素,这种情况被称为糖尿病心肌病。糖尿病心肌病缺乏特异性的诊断指标,其确诊只能通过心脏功能相关的检测,主要的特征表现为早期的心脏舒张功能不全,后期的收缩功能障碍和心力衰竭。目前其发病机制尚不完全清楚,有效的治疗方法也有限。因此,着眼于糖尿病心肌病的发病机理研究,从分子机制中探索有效治疗糖尿病心血管并发症的新靶点极其迫切、并具有重要的潜在临床意义。Calpain属于钙依赖性半胱氨酸蛋白酶家族。15个家族成员中,仅calpain-1及calpain-2在内皮细胞中表达。Calpain-1及calpain-2是由不同的催化亚基,即大亚基CAPN1或CAPN2和一个共同的小分子量的调节亚基CAPNS1组成。调节亚基是calpain-1及calpain-2稳定性和活性必不可少的部分。因此,敲除capns1将破坏calpain-1及calpain-2的生物学功能。Calpastatin是calpain-1及calpain-2的内源性蛋白酶抑制剂。Calpain/calpastatin系统在细胞生物中发挥着重要作用。我们最近的研究发现,心肌细胞特异性敲除capns1后,可减轻糖尿病前期和I型糖尿病模型小鼠的心室重构和改善心功能,提示心肌细胞calpain在糖尿病心肌病中起关键作用。心肌细胞功能障碍在糖尿病心肌病中起着核心作用,但心脏中的非心肌细胞如内皮细胞在维持冠状动脉血管功能、心室稳态和适当的心功能方面也起着重要作用。事实上calpain的激活参与了血管内皮功能障碍和糖尿病的炎症反应。综上所述,我们提出假设,内皮细胞calpain可能介导糖尿病心脏的微血管病变,成为糖尿病心肌病的一个重要致病因素。【目的】1、通过建立内皮细胞特异性calpain敲除转基因小鼠,明确内皮细胞calpain在糖尿病心肌病中的作用;2、通过研究calpain在损伤心肌微血管和促进纤维化中的作用,阐明内皮细胞calpain在糖尿病心肌病发生中的分子机制。【研究方法】1、构建血管内皮细胞特异性capns1敲除转基因小鼠,分别诱导建立糖尿病前期、I型和II型糖尿病模型。通过超声心动图观察比较capns1基因敲除小鼠和野生型小鼠的心功能;通过免疫组化检测心肌细胞和纤维化程度以及微血管损伤情况;通过离体的主动脉环出芽实验观察内皮的血管新生功能。2、在心脏微血管内皮细胞中,分别利用calpastatin腺病毒、calpain抑制剂、β-catenin质粒以及crispr/cas9 KO质粒干预细胞,观察棕榈酸模拟的代谢应激下,calpain对血管内皮细胞功能（主要包括血管成环、损伤-修复、细胞凋亡）的影响,并阐明calpain通过β-catenin介导血管内皮细胞损伤。3、观察糖尿病前期和代谢应激下内皮细胞中的TGF-β1和IL-6的表达情况。在心脏微血管内皮细胞中,抑制calpain活性后,检测TGF-β1和IL-6的表达。利用重组IL-6蛋白诱导内皮向间质细胞转分化。检测IκB并阐明calpain通过NF-κB通路介导IL-6的表达。【研究结果】1、内皮细胞capns1敲除后破坏了calpain-1及calpain-2的蛋白在内皮细胞中的表达,但是内皮细胞capns1敲除没有影响小鼠的正常生理功能。2、在三种糖尿病小鼠模型中,内皮细胞capns1敲除减少心肌纤维化和肥大、减轻心肌功能障碍;其保护作用与心肌组织毛细血管密度和冠脉血流储备增加有关。3、内皮细胞capns1基因敲除显著增加离体糖尿病小鼠主动脉环的新生管样结构形成。4、在培养的心脏微血管内皮细胞中,calpain抑制可改善血管生成,阻止代谢应激下的细胞凋亡。具体机制是,在内皮细胞capns1基因敲除小鼠和特异性敲低calpain-2的细胞中,β-catenin的蛋白水平升高;内皮细胞中β-catenin的高表达可促进血管生成,抑制细胞凋亡;而β-catenin的敲除抵消了代谢应激下calpain抑制剂的保护作用。5、IL-6在糖尿病前期模型小鼠心肌组织和代谢应激下的心脏微血管内皮细胞中表达水平明显增加;capns1敲除、calpastatin过表达或者calpain抑制剂均可降低IL-6的增加,而TGF-β1表达并未改变。IL-6在体外可直接诱导内皮细胞表达间质细胞标志分子α-SMA,诱导内皮向间质细胞转化（Endo MT）,从而促进心肌纤维化。具体机制是,代谢应激下细胞中calpain活性增加,降解IκB,激活NF-κB通路,增加IL-6的表达,从而促进内皮向间质细胞的转分化。【结论】1、血管内皮细胞calpain能够促进糖尿病心肌病的发生和发展。2、内皮细胞calpain一方面通过抑制β-catenin诱导心肌内皮细胞损伤和损害新生血管形成;另一方面通过降解IκB提高IL-6的表达,促进内皮间质化程序,导致心脏纤维化。因此,calpain可能是预防糖尿病心肌病的有效治疗靶点。