论文部分内容阅读
急性髓细胞白血病（AML）是一组高度异质性疾病，根据预后因素分组进行分层治疗是当前治疗的总趋势。目前对其预后分级的主要标准为染色体核型分析，但是，仍有超过45％的AML患者为正常核型而被归于中度危险组，这部分患者预后仍有较大不同。因此，有必要对急性髓细胞白血病进行更精细危险度分级。近年研究证明，某些分子生物学异常与急性髓细胞白血病发生、发展、预后有密切关系，能显著影响AML患者临床结局，可能成为危险度分层和评价预后的指标之一。
本研究运用定性及实时定量RT—PCR方法检测急性髓细胞白血病患者ERG基因与FOXC1基因表达，分析急性髓细胞白血病患者治疗前后FOXC1、ERG基因表达水平变化及FOXC1、ERG基因表达水平与临床特点、治疗反应的关系，初步评价它们对AML患者的临床意义和预后指导作用。
研究目的：
1、观察急性髓细胞白血病患者FOXC1基因及ERG基因的表达水平。
2、探讨FOXC1基因及ERG基因的表达水平在急性髓细胞白血病中的临床意义。
材料与方法：
1、研究对象
2006年5月～2009年3月在我科住院诊治的经临床、细胞形态学和流式细胞术检查确诊的初发或复发AML患者53例，男性21例，女性32例，中位年龄35岁。经诱导化疗获完全缓解（CR）的AML患者15例，设10名健康体检志愿者外周血标本作对照组。
2、方法
2．1分组设计
将研究对象分为初发/复发AML病例组、完全缓解组、正常对照组，观察各组中ERG和FOXC1的表达情况。
2．2单个核细胞的分离和总RNA提取
标本肝素抗凝，Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离出单个核细胞，Trizol—异丙醇/氯仿法提取总RNA。总RNA经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用核酸蛋白分析仪检测其纯度和浓度。
2．3 RT—PCR检测ERG、FOXC1 mRNA的表达
2．3．1 cDNA合成
取RNA2μ g经逆转录反应合成cDNA，—20℃备用。
2．3．2 PCR扩增及定性检测
设计合成引物，以cDNA为模板分别扩增ERG、FOXC1和内参照GAPDH的相应基因序列片断。PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像分析系统扫描成像。
2．3．3实时荧光定量PCR检测ERG、FOXC1的表达水平
应用SYBR Green荧光染料技术行实时定量PCR反应，数据由荧光定量PCR仪自动收集，计算机分析Ct值，用△Ct代表ERG、FOXC1 mRNA转录量的相对水平，△Ct越大，mRNA表达水平越低。
2．3．4 PCR产物测序鉴定
部分PCR产物送测序，将结果提交BLAST比对证实。
2．3．5 AML患者核型检测
患者的核型由本科血液病实验室采用R显带技术检测。无菌取患者骨髓2～3ml，分离单个核细胞，常规细胞培养16h后加0．05μg/ml秋水仙酰胺，阻留中期分裂相并收集细胞，经低渗、固定后制片，经Earles液处理、Giemsa染色后镜检，分析核型。
2．4患者临床资料分析
2．4．1分析患者的临床特点相关的信息，包括年龄、性别、AL亚型、初诊时血细胞计数、骨髓/外周血原始细胞比例、核型等。
2．4．2 AML患者ERG、FOXC1的表达水平与治疗反应关系
非M3型AML患者采用标准DA3+7化疗方案诱导缓解治疗。复发AML患者采用TA、IA或MA等化疗方案治疗。常规化疗2疗程观察患者治疗反应，疗效判定参照张之南等主编的《血液病诊断及疗效标准》。
2．5数据处理
SPSS13．0软件进行统计学分析，计量资料用x±SD表示，组间表达水平的比较用t检验，组间表达率、缓解率的比较用卡方检验和Fisher精确概率检验。P<0．05为差异有统计学意义。
结论：
1、初发/复发急性髓细胞白血病患者ERG基因有较高的阳性表达，并有较高的表达水平；FOXC1基因表达水平低。提示急性髓细胞白血病患者ERG基因及FOXC1基因存在表达异常。
2、ERG高表达组初诊时骨髓原始细胞比例高于低表达组，FOXC1高表达组的临床特征与低表达组无明显差异。ERG、FOXC1的表达水平亦与核型改变无关。
3、完全缓解的AML患者ERG表达水平较治疗前降低，FOXC1表达水平较治疗前升高。
4、ERG基因高表达及FOXC1基因低表达者治疗反应较差，完全缓解率低。分析ERG基因及FOXC1基因表达对急性髓细胞白血病预后判断有一定意义。